中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 付娆广西医科大学 2015年硕士导师: 张学荣共91页

摘要 : 目的:分析肝纤维化-肝癌动物模型中四个时间点肝组织差异表达的蛋白，寻找肝纤维化发展为肝癌过程中的关键蛋白。方法:利用二乙基亚硝胺建立大鼠肝纤维化-肝癌模型，提取模型大鼠中第4周，第10周，第12周，第18周四个时间点的肝组织蛋白，以正常... 展开目的:分析肝纤维化-肝癌动物模型中四个时间点肝组织差异表达的蛋白，寻找肝纤维化发展为肝癌过程中的关键蛋白。方法:利用二乙基亚硝胺建立大鼠肝纤维化-肝癌模型，提取模型大鼠中第4周，第10周，第12周，第18周四个时间点的肝组织蛋白，以正常喂养的大鼠肝组织作为对照组，采用iTRAQ结合2D-LC-MS/MS定量蛋白质组学技术分析肝组织中差异表达的蛋白质。从生物过程、细胞成分注释、分子功能、信号通路富集、蛋白之间相互作用五大方面对筛选出的差异蛋白进行深层次分析。结果:质谱分析共鉴定到2085个蛋白，各个时间点筛选到的差异表达蛋白为:第4周148个，上调蛋白61个，下调蛋白87个;第10周233个，上调蛋白87个，下调蛋白146个;第12周72个，上调蛋白38个，下调蛋白34个;第18周573个，上调蛋白210个，下调蛋白363个。在四个时间点均重复鉴定到的蛋白有23个，含上调蛋白有10个，下调蛋白有13个。GO分析表明，差异表达的蛋白在细胞生物过程功能中主要参与代谢过程、细胞过程、生物学调节和细胞信号传导等过程;在细胞位置中主要附着于细胞器、细胞膜上、细胞外基质、突触、细胞结合等位置;在分子功能中主要参与催化活性、绑定功能、转运、酶活性调节、抗氧化等功能。信号通路富集分析发现，差异表达的蛋白主要参与氨基酸降解、化学致癌、二羧酸代谢、色氨酸代谢、甾类激素的生物合成、糖酵解等相关通路。蛋白相互作用分析显示，处在蛋白互作关键节点的蛋白有细胞色素P450系3A1、细胞色素P450系2C55、谷胱甘肽转移酶α5、谷胱甘肽转移酶α2、谷胱甘肽转移酶P、增殖细胞核抗原、丝裂原活化蛋白激酶3、α2-HS-糖蛋白、细胞周期依赖性激酶4、α1巨球蛋白、醛糖还原酶和纤维蛋白原等蛋白。结论:(1)成功构建二乙基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化-肝癌模型，并在造模的四个时间点，从组织病理学上揭示了肝纤维化发展成为肝癌过程(2)细胞周期依赖性激酶4、α1巨球蛋白、α2-HS-糖蛋白、丝裂原活化蛋白激酶3、羧酸酯酶2c等参与多种生物信号途径，并处在蛋白质相互作用网络的节点上，与肝纤维化或肝癌密切相关，可能为肝纤维化发展为肝癌的关键蛋白。(3)PI3K-Akt信号通路与细胞色素P450信号通路中的丝裂原活化蛋白激酶3、细胞周期蛋白依赖性激酶4，层粘连蛋白家族、谷胱甘肽-S-转移酶家族蛋白、细胞色素P4501A2家族蛋白等30个蛋白在肝纤维化-肝癌大鼠模型中的表达量发生了显著变化，提示这两条生物信号通路可能是肝纤维化发展为肝癌的两个重要的调控通路。收起

关键词 : 肝癌肝纤维化蛋白表达 iTRAQ技术

2. 基于iTRAQ技术的针刺治疗失眠大鼠脑组织相关蛋白组学分析及效应蛋白验证研究

[学位论文] 温婧河南中医药大学 2017年博士导师: 高希言共132页

摘要 : 目的：运用蛋白质组学技术及生物信息学分析方法，筛选并鉴定针刺治疗失眠的特异性差异表达蛋白，探讨失眠及针刺治疗失眠过程可能的调控机制和生物信息途径，筛选出失眠潜在治疗靶点，为临床针刺治疗失眠提供可靠依据。方法：本研... 展开目的：运用蛋白质组学技术及生物信息学分析方法，筛选并鉴定针刺治疗失眠的特异性差异表达蛋白，探讨失眠及针刺治疗失眠过程可能的调控机制和生物信息途径，筛选出失眠潜在治疗靶点，为临床针刺治疗失眠提供可靠依据。方法：本研究主要分为三个部分：第一部分，针灸治疗失眠临床疗效的Meta分析；第二部分，基于iTRAQ（同位素标记相对和绝对定量）技术的针刺治疗失眠大鼠脑组织相关蛋白组学分析；第三部分，Western blot验证差异蛋白卷曲螺旋C2结构域蛋白1A（CC2D1A）和PH结构域蛋白5（FGD5）的表达。主要方法如下： 1.通过计算机、人工，对中文期刊全文数据库（CNKI）、维普期刊数据库（维普VIP）、万方全文数据库(CSPD)中关于针灸治疗失眠的临床随机对照试验文献进行检索，筛选符合要求的文献，按照循证医学系统评价方法，使用改良后Jadad评分量表对纳入研究的文献质量进行评价，运用RevMan5.3.5软件进行系统分析。 2.将50只雄性SD大鼠随机分为5组，分别为空白组、捆绑组、模型组、空白针刺组、模型针刺组。采用对氯苯丙氨酸（PCPA）法制作大鼠失眠模型，并通过戊巴比妥钠睡眠实验对失眠模型进行评价。空白针刺组和模型针刺组大鼠选取五脏背俞穴（“肺俞”、“心俞”、“肝俞”、“脾俞”、“肾俞”）进行针刺干预。运用iTRAQ技术分别对5组混合样品蛋白质进行肽段标记，液相色谱——串联质谱（LC-MS）进行相关蛋白质鉴定，通过生物学分析筛选出失眠及针刺治疗失眠的差异表达蛋白，探讨失眠病理及针刺治疗失眠可能的调控机制和信号传导途径。 3.运用 Western blot技术对候选差异蛋白CC2D1A、FGD5的表达进行验证。运用BCA法测定5组样品蛋白浓度，通过12%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、化学发光的方法检测两种差异蛋白的表达情况，数据处理用SPSS18.0统计软件，以p＜0.05认为差异具有统计学意义。证明CC2D1A、FGD5确实在针刺治疗失眠的生物学途径中发挥了重要作用。结果： 1.纳入符合要求的文献共10篇，失眠病例共计757例。Meta分析结果显示，针灸疗法与常规西药相比，对睡眠质量的影响方面存在统计学差异，针灸疗法优于常规西药[MD=-1.14,95%CI(-2.05,-0.23), p＜0.05]。针灸与常规西药在治疗失眠的总有效率方面的差异显著，且针灸疗效更好[Z=6.14,OR=5.24,95%CI(3.09,8.89), p＜0.01]。 2.造模后治疗前，模型组、模型针刺组大鼠的生存状态发生改变，表现为精神萎靡，反应灵敏度下降，攻击性强，进食量减少，饮水量增多，毛发光泽度降低等；与空白组相比，睡眠潜伏期延长、睡眠时间缩短（p＜0.05）。针刺治疗后，与模型组相比，模型针刺组大鼠白天活动减少，精神萎靡状态有所改善，攻击性降低，进食量增多，饮水量有所减少，且空白组、空白针刺组、模型针刺组大鼠体重增加明显（p＜0.05），空白针刺组和模型针刺组大鼠的睡眠潜伏期缩短，睡眠时间延长（p＜0.05）。 3. iTRAQ标记的5组大鼠脑组织蛋白， LC-MS共鉴定出蛋白质组3383个，得到肽段16641个。按照定量标准Ratio<0.83或Ratio>1.2，空白组-模型组有163个，模型组表达上调73个，下调86个，其中显著差异的蛋白质有金属蛋白酶抑制剂4（TIMP4）、二氢嘧啶酶相关蛋白2（DPYSL2）等；模型针刺组-空白组202个，模型针刺组上调137个，下调64个；模型组-模型针刺组117个，模型针刺组上调82个，下调35个；捆绑组-模型针刺组244个，模型针刺组表达上调88个，下调150个。维恩图分析得到34个差异蛋白，根据功能筛选出4个可能与针刺治疗失眠相关差异蛋白，CC2D1A、类脊髓小脑共济失调蛋白2（ATXN2L）、FGD5、芳香烃受体抑制因子（AhRR）。其中CC2D1A、ATXN2L在模型组表达显著上调，针刺治疗后表达下调；FGD5、AhRR在模型组表达下调或未表达，针刺治疗后表达上调。生物信息学分析提示参与失眠过程的差异蛋白主要具有结合作用、催化作用、酶活性调控作用等；参与的生物过程主要有细胞过程、生物调节、色素形成、代谢过程等。针刺治疗失眠效应的调控蛋白的主要分子功能有催化作用、结合作用、酶活性调控等。主要参与的生物学过程有细胞过程、建立蛋白质定位、转录调控、细胞内信号级联等。 4. Western blot验证结果显示：与空白组相比，捆绑组CC2D1A的表达水平无统计学意义（p＞0.05），模型组 CC2D1A表达量明显增高（p＜0.01）；与模型组比较，模型针刺组CC2D1A表达水平下调（p＜0.05）；与空白针刺组比较，模型针刺组CC2D1A表达量差异具有统计学意义（p＜0.05）。与空白组比较，捆绑组、空白针刺组FGD5表达量的差异没有统计学意义（p＞0.05），模型组 FGD5表达下调（p＜0.05）；与模型组比较，空白针刺组、模型针刺组FGD5表达上调（p＜0.05）；空白针刺组、模型针刺组也有显著差异（p＜0.05）。Western blot的结果与质谱分析结果一致。结论 1.针灸治疗失眠的随机对照试验研究对随机分配方法、失眠评定方法、组间基线等描述较之前更为详细，疗效评定具有多方位性。针灸治疗失眠的临床疗效显著，在改善睡眠质量和总有效率方面均优于常规西药。 2.针刺治疗可改善失眠大鼠的生存状态，增加失眠大鼠体重，缩短睡眠潜伏期，延长睡眠时间。 3.失眠过程中的差异蛋白主要功能涉及结合作用、催化作用和酶活性调控作用等。细胞过程、生物调节和代谢过程是参与失眠生理病理的主要生物过程，主要的差异蛋白有TIMP4、DPYSL2等。 4.针刺治疗失眠效应的蛋白主要参与细胞过程、建立蛋白质定位、转录调控、细胞内信号级联等过程。针刺通过下调CC2D1A、ATXN2L表达水平，上调FGD5、AhRR表达水平发挥生物学效应。 5. iTRAQ技术能够用于研究针灸治疗疾病的生物学过程，揭示这一复杂过程中的分子生物基础，有利于推动针灸疗效机制研究的发展。收起

关键词 : 失眠针刺疗法 iTRAQ技术蛋白组学

3. 产气荚膜梭菌生物被膜形成分子机制的研究

[学位论文] 张晓芬青海大学 2018年硕士导师: 冶贵生共72页

摘要 : 本研究采用光学显微镜和扫描电子显微镜观察培养12, 24, 48和72 h后的产气荚膜梭菌生物被膜（biofilm，BF）形态，采用RNA-seq技术和iTRAQ技术分别对产气荚膜梭菌BF菌与浮游菌进行差异表达基因和差异表达蛋白分析，以期为产气荚膜梭菌的防治及新型抗菌... 展开本研究采用光学显微镜和扫描电子显微镜观察培养12, 24, 48和72 h后的产气荚膜梭菌生物被膜（biofilm，BF）形态，采用RNA-seq技术和iTRAQ技术分别对产气荚膜梭菌BF菌与浮游菌进行差异表达基因和差异表达蛋白分析，以期为产气荚膜梭菌的防治及新型抗菌药物的研发提供理论依据。主要研究结果如下：（1）通过普通光学显微镜观察发现，随着培养时间的延长，载玻片表面附着的产气荚膜梭菌数目逐渐增多。24 h 时玻片上菌体聚集形成微菌落团，48 h时局部聚集面积增大，72 h 时形成成熟的生物被膜。通过扫描电镜观察发现， 12 h时菌体已连接形成网状结构，48 h时已形成成熟的BF，菌体被包裹在其自身分泌的基质中，形成致密结构。（2）采用RNA-seq技术对产气荚膜梭菌BF菌与浮游菌进行转录组差异表达分析，结果表明，BF菌和浮游菌相比，共有1162个基因表达差异显著，其中413个基因显著上调，749个基因显著下调。GO富集结果表明，上调基因富集在代谢过程和结合这两类中的最多，下调基因富集在杂环代谢过程、细胞膜、转移酶活动这 3 类中的最多。KEGG 富集结果表明，上调基因参与氧化磷酸化代谢、糖酵解/糖异生和丁酸代谢等。产气荚膜梭菌BF受双组分系统OmpR家族、NtrC 家族及孢子形成家族的调控。此外，Agr 群体感应系统也调控产气荚膜梭菌BF的形成。选择13个差异基因进行实时荧光定量PCR验证，结果显示6个差异基因表达上调，7个差异基因表达下调，差异表达趋势与转录组测序结果一致。（3）采用iTRAQ技术对产气荚膜梭菌BF菌与浮游菌进行差异蛋白质组学分析，结果表明BF菌与浮游菌表达差异显著的蛋白总数为153个，其中上调的蛋白有48个，下调的蛋白有105个。差异蛋白富集在94个GO功能类别中，富集到生物过程的有细胞氧化还原稳态、从头嘧啶碱基生物合成过程和金属离子转运等。富集到分子功能的包括磷脂酶 C 活性、氧化还原酶活性、蛋白质二硫氧化还原酶活性等。KEGG富集结果表明，差异蛋白富集到了52个通路中，如长寿调节通路、FoxO信号通路、RIG-I样受体信号通路等。（4）产气荚膜梭菌 BF 菌与浮游菌转录组和蛋白质组关联分析结果显示，转录组和蛋白组共同鉴定到的差异表达基因（蛋白）有77个。mRNA-蛋白质一致表达上调的差异基因主要参与丙酮酸代谢和嘧啶代谢；mRNA-蛋白质一致表达下调的差异基因主要参与嘧啶代谢、淀粉与蔗糖代谢、碳代谢、硫胺素代谢。收起

关键词 : 产气荚膜梭菌生物被膜 RNA-seq技术 iTRAQ技术

4. 基于iTRAQ技术探讨孕期恐应激对胎盘发育及其组织蛋白表达的影响

[学位论文] 李改河南中医药大学 2019年硕士导师: 杨丽萍共93页

摘要 : 目的：利用iTARQ技术和定量的WesternBlot技术评价孕期恐应激对其胎盘组织蛋白质表达的影响，以期从蛋白水平探讨孕期恐应激影响其子代发育的胎盘调控机制。方法：对购买的70只80日龄Wistar大鼠(其中雌鼠45只，体重235±15g；雄鼠2... 展开目的：利用iTARQ技术和定量的WesternBlot技术评价孕期恐应激对其胎盘组织蛋白质表达的影响，以期从蛋白水平探讨孕期恐应激影响其子代发育的胎盘调控机制。方法：对购买的70只80日龄Wistar大鼠(其中雌鼠45只，体重235±15g；雄鼠25只，体重270±20g)适应性喂养一周，采用旷场实验和Morris水迷宫实验选取基准线一致的大鼠按雌雄2∶1合笼，次日检查受孕情况。按随机数字表法将陆续受孕的大鼠40只分为对照组和应激组，每组20只。另选取雄鼠10只留做电击鼠，其余鼠处死。从受孕第一天开始，心理应激组孕鼠采用旁观电击法进行造模，对照组只放电击笼中不予电击。在孕20日，每组随机抽取10只孕鼠进行剖宫取胎盘和仔鼠，并观察每只孕鼠的存活胎、吸收胎及死胎情况和测量胎盘的重量(PW )、直径、面积和仔鼠的重量，计算PW/FW比率，每组剩余10只孕鼠饲养至自然生产，记录其产仔数并观察仔鼠的一般发育情况，至仔鼠30日龄运用旷场实验和Morris水迷宫实验检测仔鼠发育情况。采用iTRAQ技术按FDR＜1%、ratio≥1.2或≤0.832且P＜0.05的标准选取胎盘组织差异表达蛋白质，通过GO数据库及KEGGPathway数据库进行GO功能和Pathway通路进行分析，运用Cytoscape软件做差异表达蛋白的网络互作分析，并通过WesternBlot技术对筛选出的部分差异表达蛋白质进行验证。结果： 1.孕期恐应激对胎盘和仔鼠发育的影响及二者之间的相关性 1.1.孕期恐应激对胎盘、新生仔鼠及30日龄仔鼠的影响与对照组比较，应激组胎盘重量减轻，胎盘面积和胎盘直径减小，差异均有统计学意义(P＜0.05)，与对照组比较，应激组仔鼠体重减轻，PW/FW下降，仔数出牙、被毛和惊跳反射时间均较晚，差异有统计学意义(P＜0.05)；应激组仔鼠张耳、开眼和翻身时间均较晚，产仔数减少，差异无统计学意义(P＞0.05)；且应激组中吸收胎的发生率是对照组的2倍多，死胎发生率是对照组的1.6倍多；与对照组相比，应激组30日龄仔鼠水平得分、垂直得分均减少，大便粒数增多，差异有统计学意义(P＜0.05)；应激组修饰次数均减少，差异无统计学意义(P＞0.05)；与对照组比，应激组30日龄仔鼠第1，2,3天平均逃避潜伏期和20%边缘区域停留时间均延长、游泳速度减慢及跨台次数减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 1.2.孕期恐应激所致胎盘发育与新生仔鼠和30日龄仔鼠发育的相关性胎盘重量和胎盘面积分别与仔鼠体重呈正相关，差异有统计学意义(P＜0.05)；胎盘重量、胎盘面积、胎盘直径和PW/FW分别与仔鼠出牙时间呈负相关，差异有统计学意义(P＜0.05)；胎盘重量、胎盘面积、胎盘直径和PW/FW分别与仔鼠张耳、开眼、被毛、翻身和惊跳反射时间呈负相关，PW/FW和胎盘直径与仔鼠体重呈正相关，差异均无统计学意义(P＞0.05)。与对照组比，胎盘重量和胎盘面积与水平得分、垂直得分、游泳速度和跨台次数呈正比，胎盘重量、胎盘面积和PW/FW与大便粒数、20%边缘区域呈反比，胎盘直径和胎盘面积与平均逃避潜伏期呈负相关，差异有统计学意义(P＜0.05)；胎盘重量与修饰次数呈正相关，胎盘直径和PW/FW与水平得分、垂直得分、游泳速度、跨台次数呈正相关，胎盘直径与大便粒数、20%边缘区域呈负相关，胎盘重量、胎盘直径、胎盘面积和PW/FW与修饰次数呈正相关，PW/FW与平均逃避潜伏期呈负相关，差异均无统计学意义(P＞0.05)。 2.孕期恐应激对胎盘组织蛋白质表达检测结果 2.1.差异表达蛋白的鉴定结果在FDR＜1%、ratio≥1.2或≤0.832且P＜0.05的条件下共筛选出300种差异表达蛋白，其中有152种表达上调，148种表达下调； 2.2.差异表达蛋白GO功能富集结果 300种差异表达蛋白共涉及38种细胞组分、103种生物过程和41种分子功能。其中细胞组分主要涉及了核糖体、染色质、ATP酶及细胞外基质等；生物过程主要涉及细胞代谢过程的负调控、应激反应的调节、蛋白质靶向调控、肌动蛋白丝解聚作用、和葡萄糖稳态等；分子功能主要涉及核糖体的结构组成、细胞外基质结构组成、氨基酸跨膜转运体活性及伴侣蛋白绑定等； 2.3.差异表达蛋白Pathway通路分析结果 300个差异表达蛋白共涉及12种生物途径，主要与应激相关的涉及核糖体信号通路、PI3K-AKT信号传导通路和ECM-受体相互作用等。 2.4.差异表达蛋白网络互作分析结果对300种差异表达蛋白进行互作网络分析，110个差异蛋白之间存在相互作用且构建出网络互作图，余190个差异表达蛋白不存在网络互作。其中，在相互作用网络中DJ-1、PPARγ、14-3-3ζ、Cofilin-1、FTO、14-3-3θ蛋白、HSP90β以及HSP60等8个蛋白的点度中心度数值均较大； 3.对差异表达蛋白的验证结果选择DJ-1、14-3-3ζ、Cofilin-1、HSP60和ATP1A15个差异表达蛋白进行验证。与对照组比较，应激组DJ-1、14-3-3ζ、Cofilin-1、HSP60四个蛋白均有下调趋势，与iTRAQ结果检测一致。结论： 1.孕期恐应激影响胎盘、新生仔鼠和30日龄仔鼠的正常发育，且胎盘发育与新生仔鼠和30日龄仔鼠发育有一定的相关性； 2.孕期恐应激影响胎盘上的蛋白质主要分布于血管、线粒体及细胞骨架上，并通过核糖体信号通路传导、PI3K/AKT信号通路传导及ECM-受体相互作用等途径实现对仔鼠发育的影响。收起

关键词 : 胎盘发育孕期恐应激组织蛋白 iTRAQ技术

5. 苯乳酸与乳酸联用对蜡样芽孢杆菌协同抑菌效应及作用机理

[学位论文] 付浴男河北科技大学 2020年硕士导师: 宁亚维共81页

摘要 : 苯乳酸是一种新型有机酸，具有抑菌谱广、安全性高、可提高免疫力等优点，在食品防腐中具有较高应用潜力。苯乳酸可由乳酸菌代谢产生，且前期研究发现苯乳酸与乳酸共存时，抑菌活性会增强。因此，本研究以蜡样芽孢杆菌作为指示菌，考察苯乳酸与乳酸的... 展开苯乳酸是一种新型有机酸，具有抑菌谱广、安全性高、可提高免疫力等优点，在食品防腐中具有较高应用潜力。苯乳酸可由乳酸菌代谢产生，且前期研究发现苯乳酸与乳酸共存时，抑菌活性会增强。因此，本研究以蜡样芽孢杆菌作为指示菌，考察苯乳酸与乳酸的协同抑菌性，以期为苯乳酸在食品防腐中的应用和拮抗乳酸菌的筛选提供参考。首先，研究了苯乳酸与乳酸对蜡样芽孢杆菌的联合抑菌效应及抑菌靶位。采用二倍稀释法考察了苯乳酸和乳酸对蜡样芽孢杆菌的最小抑菌浓度;联合抑菌指数法与时间-杀菌曲线评价了苯乳酸与乳酸的联合抑菌效应;从膜电势、细胞膜完整性、细胞形态结构等方面分析了苯乳酸和乳酸对蜡样芽孢杆菌的抑菌靶位。结果表明:苯乳酸和乳酸对蜡样芽孢杆菌的最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)分别为1.25、0.625mg/mL，苯乳酸与乳酸组合的部分抑菌浓度指数为0.75，表明了苯乳酸与乳酸对蜡样芽孢杆菌具有协同抑制效应。采用DiSC3(5)荧光探针标记考察膜电势的变化，1/4MIC苯乳酸、1/2MIC乳酸及1/4MIC苯乳酸+1/2MIC乳酸联用组处理后，荧光强度分别为784、797.2、853，表明苯乳酸、乳酸消散了膜电势，而苯乳酸和乳酸联用则协同增强了损伤程度;通过荧光探针SYTO9/PI标记考察膜完整性，结果显示1/4MIC苯乳酸、1/2MIC乳酸及联用组PI沾染率分别为68％、79.4％、97.5％,表明苯乳酸与乳酸可以协同破坏细胞膜完整性;采用扫描电镜和透射电镜考察形态结构损伤，表明经过苯乳酸、乳酸处理后，蜡样芽孢杆菌菌体变形、细胞膜模糊、细胞质密度降低。其次，考察了苯乳酸和乳酸联用对蛋白质组的影响。采用蛋白质电泳考察了苯乳酸、乳酸对蛋白质的影响，表明苯乳酸、乳酸干扰蛋白质合成从而对蜡样芽孢杆菌发挥抑菌作用。基于iTRAQ技术研究了苯乳酸与乳酸联用对蜡样芽孢杆菌的协同抑菌机理。经蛋白质组学分析，MIC苯乳酸、MIC乳酸、1/4MIC苯乳酸+1/2MIC乳酸组差异表达蛋白数量分别为:30个（19个上调蛋白，11个下调蛋白）、125个(70个上调蛋白，55个下调蛋白)、35个（17个上调蛋白，18个下调蛋白）。在分子功能及细胞成分的影响中，MIC苯乳酸、MIC乳酸、1/4MIC苯乳酸+1/2MIC乳酸组对离子键合、细胞质影响最大。基于蛋白质组学结果通过生物信息学分析了苯乳酸与乳酸对蜡样芽胞杆菌代谢通路的影响，结果显示:苯乳酸通过抑制钾离子转运、干扰核糖体功能等发挥抑菌作用;乳酸通过干扰核糖体功能、TCA循环、磷转运以及嘌呤和嘧啶的代谢，并调节毒力因子的表达从而导致细胞死亡;苯乳酸和乳酸联用通过抑制钾离子及磷转运，并影响核糖体、嘌呤和嘧啶的合成从而发挥抑菌作用。最后，研究了苯乳酸与乳酸对蜡样芽孢杆菌芽孢的抑菌活性及抑菌机理。通过二倍稀释法考察了苯乳酸和乳酸对蜡样芽孢杆菌芽孢的最小抑芽孢浓度分别为1.25、0.5mg/mL，部分抑芽孢浓度指数为0.75;采用MTT法考察了苯乳酸、乳酸对芽孢氧化代谢的影响，结果表明作用60min后MIC苯乳酸、MIC乳酸及联用组对芽孢氧化代谢产生抑制作用且联用组显示出协同抑制作用;通过PI沾染结合流式细胞术考察了苯乳酸和乳酸对芽孢膜完整性的影响，作用120min后，所有组别PI的沾染率均在35％以下，但联用组对芽孢膜的破坏展现出协同抑制作用;通过荧光染料DIOC2染色分析了苯乳酸和乳酸对芽孢膜电位的影响，结果显示MIC苯乳酸、MIC乳酸及联用组处理后，芽孢荧光强度明显降低，表明苯乳酸、乳酸在芽孢萌发后通过消散膜电位抑制芽孢。收起

关键词 : 苯乳酸协同抑菌 iTRAQ技术芽孢抑菌机理

6. 基于iTRAQ技术对甜菜块根膨大蛋白质组学的研究

[学位论文] 王雪峰内蒙古农业大学 2016年硕士导师: 张少英共81页

摘要 : 甜菜（Beta Vulgaris L.）是全球主要的糖料作物之一，以其块根为制糖原料，种植以块根的大小和含糖为经济指标。研究甜菜块根膨大过程中的蛋白质组学变化对了解甜菜块根增长的分子机制有着重要作用。本研究采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）的方... 展开

关键词 : 甜菜块根膨大蛋白质组学 iTRAQ技术

7. 长角血蜱唾液腺退化分子机制研究

[学位论文] 王笑河北师范大学 2018年硕士导师: 王辉共72页

摘要 : 蜱是一种专性吸血的体外寄生虫，携带并传播病原体，可导致人、野生动物及家畜感染上多种疾病，不但对人类健康造成危害，同时也严重影响着畜牧业的发展。蜱类包括硬蜱、软蜱和纳蜱三科，其中硬蜱种类最多，分布最广泛，危害最严重。本课题的研究对象... 展开蜱是一种专性吸血的体外寄生虫，携带并传播病原体，可导致人、野生动物及家畜感染上多种疾病，不但对人类健康造成危害，同时也严重影响着畜牧业的发展。蜱类包括硬蜱、软蜱和纳蜱三科，其中硬蜱种类最多，分布最广泛，危害最严重。本课题的研究对象长角血蜱（ Haemaphysalis longicornis）隶属于硬蜱科 Ixodidae，血蜱属Haemaphysalis，广泛分布于亚洲东部以及澳大利亚。该蜱种在中国的分布也非常广泛，是一种携带多种病原体的蜱种，严重影响着人类健康和畜牧业发展，对其研究具有重要的社会和经济意义。蜱为了能够快速不断地吸食宿主血液，进化出了一对特殊的唾液腺。这种特殊的唾液腺可分泌大量辅助吸血的大分子和小分子物质，具有阻止宿主血液凝固，以及抵抗宿主免疫反应等功能。相对于雄蜱，雌蜱的危害更为严重。雌蜱具有超强的繁殖能力，为了完成整个生活史，需要吸食大量宿主血液并传播病原体。当雌蜱饱血后，即停止吸血并从宿主体表脱落，唾液腺此时已经失去存在的意义，开始迅速退化。研究唾液腺的退化对于了解蜱类唾液腺的机能和调节机制，控制蜱类吸血并综合提高蜱疫防控机制具有重要意义。为了明晰蜱类唾液腺退化的分子机制，本研究以长角血蜱雌蜱为研究对象，采用定量蛋白质组学技术全面分析唾液腺退化过程中全部蛋白的动态变化，寻找在唾液腺退化过程中起到重要调控作用的蛋白质，以期为蜱类的生物防治提供一些理论依据。本研究利用iTRAQ定量蛋白质组学技术分析了雌蜱唾液腺退化过程中4个时间点所有蛋白的表达量变化，最终鉴定到2302条差异表达蛋白。运用生物信息学对差异表达蛋白进行全方位分析，结果显示细胞凋亡信号通路和三羧酸循环过程在退化过程中起到重要作用。最终筛选出几种重要蛋白进行进一步功能分析：F0F1型ATP合成酶、NADH泛醌氧化还原酶、细胞色素C、凋亡诱导因子、溶酶体酸性磷酸酶。我们对这些蛋白逐一进行RNA干扰，这五条蛋白被干扰后，相应靶基因的转录水平均有不同程度的下降。其中F0F1型ATP合成酶、NADH泛醌氧化还原酶、细胞色素C和凋亡诱导因子被干扰后的雌蜱饱血体重、产卵量和孵化率等均发生下降。这些蛋白在未来很可能成为防控长角血蜱的药物靶点，本课题的研究结果不仅全方位诠释了长角血蜱唾液腺退化的分子机制，也为蜱类的生物防治提供了一些理论依据。收起

关键词 : 长角血蜱唾液腺退化机制 iTRAQ技术

8. 基于iTRAQ技术对印度梨形孢增强植物黄萎病抗性机制的研究

[学位论文] 胡毅山西农业大学 2019年硕士导师: 孔照胜;李梅兰共55页

摘要 : 我国是世界最大的蔬菜生产国和消费国，各类蔬菜在国民生活和经济上占用重要地位，黄萎病是主要由大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)引起的土传维管束病害。大丽轮枝菌具有致病力强、宿主范围广存活时间长等特点因此黄萎病的防止一直是各类蔬菜生产中的... 展开我国是世界最大的蔬菜生产国和消费国，各类蔬菜在国民生活和经济上占用重要地位，黄萎病是主要由大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)引起的土传维管束病害。大丽轮枝菌具有致病力强、宿主范围广存活时间长等特点因此黄萎病的防止一直是各类蔬菜生产中的重大难题。1998年，印度科学家Verma等人首次发现并命名印度梨形孢(Piriformosporaindica)，已有的研究表明印度梨形孢在植物促生和抵抗多种植物病害方面都有着显著的作用。目前对于黄萎病的研究热门主要是棉花黄萎病，本试验将以棉花为主要研究材料，围绕印度梨形孢提高植物对黄萎病的抗性机制展开研究，以期能得到一套较为完善的体系并应用到各类蔬菜的生产中，以减轻各类蔬菜黄萎病害的发生。在本次研究中，平板对峙实验结果表明，印度梨形孢可以体外抑制大丽轮枝菌的生长；而印度梨形孢和大丽轮枝菌共侵染陆地棉TM-1的实验结果表明，经过预接种印度梨形孢的棉花，黄萎病发生的频率和程度都有明显的降低。棉花根系总蛋白iTRAQ实验结果表明，在所有鉴定到1069个蛋白中，棉花根系的蛋白表达情况存在着较大差异。对其中104个可信差异蛋白进行组学分析，结果表明104个蛋白共富集到38个GO条目中，KEGG结果表明，104个差异蛋白共富集到64条代谢通路中。为了进一步验证基因的表达情况，选择了α亚麻酸代谢通路中4个基因和与抗病功能相关的4个基因进行qRT-PCR检测，发现其中7个基因在转录层面和蛋白层面表达情况相一致，但表达量存在明显区别，推测可能是因为蛋白的翻译后修饰造成的。上述研究结果表明，印度梨形孢在增强棉花黄萎病抗性方面有着显著的作用，印度梨形孢的定殖可以影响植物α亚麻酸的代谢途径进而影响JA的生物合成，同时还可以影响一些抗病相关基因的表达。整体而言，植物抗病是一个复杂的过程，印度梨形孢可以增强植物对黄萎病抗性的机制还有待进一步的探究。收起

关键词 : 印度梨形孢植物黄萎病抗性机制 iTRAQ技术

9. 广西肝癌发生的血清分子标志物筛选及血清糖蛋白凝集素亲和谱的比较

[学位论文] 景瑞广西医科大学 2013年硕士导师: 张春燕共118页

摘要 : 肝癌是我国常见的死亡率较高的恶性肿瘤之一。其侵袭性强、预后差，而且目前对于肝癌的诊断率并不理想，尤其是早期肝癌。但是，早期肝癌的预后好，因此肝癌的早期发现及诊断尤为重要。AFP是目前公认而且最常用的肝癌诊断标志物，但是AFP灵敏度仅为30... 展开肝癌是我国常见的死亡率较高的恶性肿瘤之一。其侵袭性强、预后差，而且目前对于肝癌的诊断率并不理想，尤其是早期肝癌。但是，早期肝癌的预后好，因此肝癌的早期发现及诊断尤为重要。AFP是目前公认而且最常用的肝癌诊断标志物，但是AFP灵敏度仅为30.9％-75.0％，特异度为63.0％-99.5％。所以，寻找新的灵敏度和特异度更高的肝癌标志物是目前亟待解决的难题。蛋白质组学能通过对全体蛋白质表达的规模化分析，研究生物过程相关蛋白质的动态表达和功能的改变;对于寻找疾病诊断的特异性标志物以及对疾病的发病机理的研究来说，是一种有效的高通量的研究方法，可以获得传统手段无法得到的蛋白标志物，目前已经成为寻找新的肿瘤蛋白标志物的主要方法。与此同时，大多数肿瘤标志物都属于糖蛋白，糖蛋白的糖链(聚糖，glycan)的改变对其结构和功能都有重要影响。糖组学是继基因组学、蛋白质组学之后一门新兴的正日益受到人们关注的学科，利用糖组学技术来发现肝癌的发生过程中血清蛋白糖链的变化，可以为寻找肝癌早期诊断的相关标志物提供重要参考。本研究首先运用蛋白质组学研究方法及手段，通过对正常人、肝炎患者、肝硬化患者及肝癌患者的血清进行差异蛋白质组学分析，筛选出了一些有潜在诊断价值的差异蛋白质，并对其中部分差异蛋白质进行了验证和进一步分析。同时，我们又通过凝集素亲和层析技术对这四组样本进行了凝集素亲和谱的比较，提取了样本的糖谱信息。第一部分肝癌发生过程中血清分子标志物的筛选研究本部分实验主要目的是通过同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术对肝癌发生过程中血清蛋白质组进行动态定量分析，筛选出肝癌发生过程中的差异蛋白质分子标志物，并挑选出具有一定肝癌早期诊断意义的潜在分子标志物。首先，从广西肝癌高发区现场建立的肝癌高危人群队列的人血清标本库中选取四组血清样本，分别是正常对照组、肝炎组、肝硬化组和肝癌组。首先对各实验组去除血清中14种高丰度蛋白，浓缩后再进行稳定同位素iTRAQ试剂标记，经过2次反向色谱柱分离，质谱鉴定，我们共得到316个(95％可信度)蛋白。在这些蛋白中，以邻近时间点蛋白比值＞1.2或＜0.8，P＜0.05，EF＜2为差异蛋白筛选标准，共筛选出93个差异蛋白。肝炎组、肝硬化组、肝癌组分别与正常对照组比较有43、70、51个差异蛋白。将所有差异蛋白进行GO分类可知，在细胞定位方面，这些蛋白主要位于细胞外基质(53％)。在生物学过程方面，这些差异蛋白主要参与生物调控(33％)、代谢过程(25％)和免疫反应(14％)等生物学过程。在分子功能方面，这些差异蛋白主要涉及蛋白结合(37％)和酶活性(35％)等方面。对部分差异蛋白(GELS、QSOX1、CD14)进行免疫印迹验证，对CD14进行酶联免疫吸附测定，结果证明质谱结果可靠。最后，通过对各病例AFP值及CD14表达水平进行Logistic回归分析及ROC曲线分析发现，AFP单独诊断肝癌时AUC为0.646，P＞0.05，差异无统计学意义，说明本研究中AFP不能诊断肝癌与肝硬化，其Cut-off值为191.4ng/ml时，灵敏度为31.6％，特异度为94.4％;CD14单独诊断肝癌时AUC为0.760，P＜0.05，差异有统计学意义，说明CD14具有一定的诊断肝癌与肝硬化的能力，其Cut-off值为3.16ng/ml时，灵敏度为94.7％，特异度为50％;而差异蛋白CD14与AFP联用时，AUC为0.889，P＜0.05，差异有统计学意义，ROC曲线下面积明显提高，灵敏度为84.2％，特异度为83.3％，说明两者联用可提高早期肝癌诊断率。以上结果说明本次实验筛查出的肝癌相关差异蛋白CD14，具有一定的诊断肝癌与肝硬化的能力，与AFP联用时可提高早期肝癌诊断率，因此，CD14可能成为诊断早期肝癌的潜在分子标志物。第二部分肝癌发生过程中血清糖蛋白凝集素亲和谱的比较本部分实验主要目的是从糖组学方面利用凝集素亲和层析技术比较肝癌发生过程中凝集素亲和谱的变化。首先，建立一种凝胶基质的凝集素芯片技术，其可行性及准确性已经得到验证。然后应用此种含50种凝集素的芯片技术，对正常对照组、肝炎组、肝硬化组及肝癌组四组样本进行检测，选取在这四组样本中均能检测到的亲和信号增强的凝集素，重复实验三次，发现在三次实验中共同检测到的凝集素共14种，分别为AAL、ACL、ConA、LCA、MPL、NML、PHA-E、PHA-L、PSA、RCA-I、STL、VAL、WGA和SNA。说明在肝癌发生过程中患者血清里可能存在增多的岩藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、平分型GlcNAc、末端β1-4链接半乳糖等结构。肝癌组与其他组比较，除SNA外，每种凝集素亲和信号强度差异均有统计学意义(P＜0.05)。SNA在肝癌组与肝炎组中亲和信号强度差异无统计学意义(P＞0.05)，通过查找相关文献发现，这可能与唾液酸转移酶活性在急性与慢性病变中大小不同有关。然后从中选取了差异较大的ConA、LCA和PHA-E三种生物素标记的凝集素做凝集素印迹，进一步对芯片结果进行验证，结果显示，凝集素印迹结果与芯片结果一致，说明凝集素芯片结果是可靠的。本部分实验结果表明，肝癌患者血清中含有这些凝集素特异性亲和糖链的蛋白质可能具有潜在诊断价值，为继续寻找肝癌早期诊断的相关标志物提供了重要参考。结论 1、通过iTRAQ技术结合LC-MS/MS技术揭示肝癌发生过程中血清蛋白质组学的动态变化，共鉴定出93个差异蛋白。肝炎组、肝硬化组、肝癌组分别与正常对照组比较有43、70、51个差异蛋白。 2、CD14单独诊断肝癌时AUC为0.760，P＜0.05，说明CD14具有一定的诊断肝硬化与肝癌的能力;CD14与AFP联用时，AUC为0.889，P＜0.05，ROC曲线下面积明显提高，说明两者联用可提高早期肝癌诊断率。CD14可以作为诊断早期肝癌的潜在分子标志物。 3、通过凝集素芯片技术筛选出14种亲和信号增强的凝集素，含有这些凝集素特异性亲和糖链的蛋白质可能成为诊断早期肝癌的潜在标志物。创新点 1、在广西肝癌高发区肝癌高危人群队列筛查和定期复查随访所建立的血清样本和信息库中选取样本作为研究对象，能动态的观察肝癌高危对象的肝癌进程中血清相关指标的变化。 2、采用iTRAQ技术结合LC-MS/MS液质联用技术动态分析肝癌发生过程中的血清蛋白质组的表达谱，并发现CD14可能成为早期肝癌的潜在分子标志物。 3、建立了肝癌的发生过程的血清凝集素亲和谱。潜在应用价值 CD14具有一定的区分诊断肝癌与肝硬化的能力，可能成为潜在的早期肝癌诊断分子标志物。收起

关键词 : 肝癌分子标志物 iTRAQ技术凝集素糖链 CD14

10. 萝卜肉质根膨大性状相关基因发掘与功能分析

[学位论文] 谢洋南京农业大学 2018年博士导师: 柳李旺共111页

摘要 : 萝卜是以内质根为食用器官的重要的世界性蔬菜作物之一，属于十字花科一、二年生草本植物，含有丰富的碳水化合物、粗纤维、维生素C、蛋白质和萝卜硫素等营养物质。肉质根是萝卜最显著的特征，不同品种根型差异明显。肉质根膨大发育的好坏直接关系到萝... 展开萝卜是以内质根为食用器官的重要的世界性蔬菜作物之一，属于十字花科一、二年生草本植物，含有丰富的碳水化合物、粗纤维、维生素C、蛋白质和萝卜硫素等营养物质。肉质根是萝卜最显著的特征，不同品种根型差异明显。肉质根膨大发育的好坏直接关系到萝卜的产量和品质性状。因此，开展萝卜肉质根膨大机制的研究具有十分重要的意义。过去几十年，关于萝卜肉质根形态、生理和解剖特征方面进行了一系列研究。结果表明，肉质根膨大是一个动态变化过程，由遗传、环境及生理因素相互作用产生的结果。本质上，肉质根膨大是相关基因程序性表达作用的结果，但关于萝卜肉质根膨大性状相关基因发掘及其功能验证工作的研究报道较少，致使萝卜肉质根膨大分子调控网络尚未阐明。鉴于此，本研究利用iTRAQ和RNA-seq技术，对具有显著差异根型的萝卜肉质根膨大三个发育时期(破肚前期S1、破肚期S2、膨大期S3)进行蛋白组、转录组和miRNA的综合分析，鉴定与肉质根膨大性状相关基因;并通过构建人工小RNA表达载体和遗传转化拟南芥的方式初步探究基因功能，为深入解析萝卜肉质根膨大分子机制提供理论依据。主要研究结果如下: 1.为了分离鉴定‘NAU-YH’樱桃型萝卜（小型）肉质根膨大过程中蛋白质组学信息，本研究利用iTRAQ技术鉴定肉质根膨大三个时期差异表达蛋白，在三个比较文库中分别鉴定到1222个(S1vs.S2)、1046个(S1vs.S3)和940个(S2vs.S3)差异表达蛋白，其中上调蛋白分别有528个(S1vs.S2)、459个(S1vs.S3)和515个(S2vs.S3)，并且有26个差异蛋白在三对比较文库中都上调表达。KEGG富集分析显示，三个文库显著富集通路主要包括‘次生代谢产物合成’(ko01110)、‘半胱氨酸和蛋氨酸代谢’(ko00270)、‘谷胱甘肽代谢’(ko00480)和‘苯丙氨酸代谢’(ko00360)等;RT-qPCR分析结果显示，差异蛋白在mRNA水平表达模式与相应的iTRAQ测序数据结果趋势基本一致，说明iTRAQ测序结果具有可靠性。与此同时，通过蛋白质组和转录组数据关联分析，鉴定到一些功能蛋白CDC5、EXPB1和XTH24参与萝卜肉质根膨大过程中的细胞分裂、细胞膨大和细胞伸长。 2.为分析不同根型萝卜肉质根膨大过程中差异表达基因与差异表达miRNA，利用NGS技术，以具有显著差异根型的三种代表性萝卜高代自交系‘NAU-YH’（小型）、‘NAU-YB’（中型）和‘NAU-DY’（大型）为研究试材，进行转录组和miRNA综合分析来鉴定肉质根膨大过程中差异表达基因(DEGs)和差异表达的miRNA(DEMs)。本研究在‘NAU-DY’和‘NAU-YB’两个高代自交系中鉴定到2606个共有DEGs，在‘NAU-DY’和‘NAU-YH’两个高代自交系中鉴定到16个共有DEMs和12个DEMs特异于大根型萝卜‘NAU-DY’。GO和KEGG分析显示‘主要碳水化合物代谢过程’和‘淀粉与蔗糖代谢’分别为萝卜肉质根膨大过程中差异基因显著富集的条目和通路。RT-qPCR分析显示，随机选择的激素信号转导相关基因的表达特征与从RNA-seq数据中获得的结果呈强相关性(皮尔逊相关系数r=0.67)。此外，整合转录组和miRNA数据分析发现，miR393(靶向bHLH77)、miR167(靶向ARF8)和miR5658(靶向APL)可能与萝卜根型差异有关。 3.生物组学分析鉴定到RsSUS1在大、中、小根型萝卜中表达模式不同，在大根型肉质根膨大发育中表现出较高表达模式，而在早期幼根中表达水平很低，表明RsSUS1可能特异地促进肉质根膨大形成;RsIAA26在‘S2vsS1’比较组中显著上调，说明RsIAA26可能在肉质根膨大起始阶段起着重要作用;RsCDC5在肉质根膨大过程中显著上调表达，可能对内质根膨大过程中细胞分裂起着积极调控作用。为了验证这三个肉质根膨大性状相关基因的生物学功能，以拟南芥pre-miR319a为前体骨架，构建了人工小RNA表达载体(RsIAA26ami、RsSUS1ami、RsCDC5ami)，利用农杆菌介导法遗传转化到拟南芥;并对T2和T3代阳性植株进行表型鉴定。结果显示，特异沉默RsIAA26后植株较野生型植株表现出生长发育占优势的现象，如‘叶盘’形成较快和提前进入生殖生长阶段;特异沉默RsSUS1的转基因植株较野生型表现出幼苗期侧根发达，成株期主根生长受抑制和侧根数增加以及种子变小;特异沉默RsCDC5的转基因植株较野生型表现出叶宽、根长和种荚都变小，生长发育受阻，其中部分植株表现败育。以上结果初步证明RsSUS1和RsCDC5在植物根生长与发育过程中起着重要作用;推测RsIAA26可通过系列途径减缓萝卜地上部生长发育进程，从而促进肉质根膨大形成与发育。收起

关键词 : 萝卜肉质根 iTRAQ技术转录组 miRNA 人工小RNA