中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 刘燕飞中国科学院大学 2021年硕士导师: 梁振昌共75页

摘要 : 葡萄（VitisviniferaL.）是世界上具有重要经济价值的果树之一。葡萄体细胞胚胎的诱导发生是获得完整葡萄植株的重要途径，对于葡萄基因研究和葡萄育种都具有重要的意义。本实验主要通过两个方面进行葡萄体胚发生相关基因的挖掘与筛选:一是利用‘41B’... 展开葡萄（VitisviniferaL.）是世界上具有重要经济价值的果树之一。葡萄体细胞胚胎的诱导发生是获得完整葡萄植株的重要途径，对于葡萄基因研究和葡萄育种都具有重要的意义。本实验主要通过两个方面进行葡萄体胚发生相关基因的挖掘与筛选:一是利用‘41B’葡萄胚性细胞进行再生试验，分别从诱导起始到体胚发生这一完整过程中的不同时间点取样，进行转录组测序（RNA-seq）和ATAC-seq测序分析，筛选候选基因;二是根据文献报道的再生基因，鉴定葡萄的同源基因，结合已有的测序数据和定量分析结果，分析这些基因是否在葡萄体胚发生过程中发挥作用。通过上述两部分研究工作，本研究取得的主要成果如下: 1.‘41B’胚性细胞在再生培养基上经3周诱导培养即可形成体细胞胚胎，因此分别在再生过程的第0、7、14、17和21天取样进行了RNA-seq和ATAC-seq测序分析，经过与对照组（第0天）数据进行差异化分析，最终筛选到了VvNF-YB6、VvCEA1、VvSLE2、VvIAA11、VvMYB4和VvIAA9等候选基因。 2.根据文献报道结果，我们初步选定了15个与体胚形成或植株再生相关的基因，利用qPCR对这些基因的表达量进行分析，我们发现VvWUS、VvSTM、VvWOX2、VvWOX9、VvBBM、VvFUS3和VvLEC1等7个基因在胚性细胞中的表达量要显著高于非胚性细胞，推测这些基因在葡萄细胞胚性维持或体胚发生过程中发挥着重要作用。 3.利用CRISPR/Cas9技术在‘41B’胚性细胞中对VvWUS、VvSTM、VvWOX2、VvWOX9、VvBBM、VvFUS3和VvLEC1等7个候选基因分别进行了敲除，同时也对VvWUS和VvWOX2、VvWUS和VvWOX9、VvWOX2和VvWOX9、VvFUS3和VvLEC1以及VvBBM和VvSTM等基因组合进行了双敲除试验，目前已成功得到转化细胞;经过检测，VvLEC1和VvWUS两个基因的靶位点处发生了编辑，实现了基因的敲除。 4.从葡萄‘霞多丽’中分别克隆了候选基因VvWUS、VvSTM、VvWOX2、VvWOX9、VvBBM、VvFUS3和VvLEC1的编码序列(codingsequence，CDS)进行表达载体的构建，目前成功获得除VvWOX2外的候选基因的过表达载体。通过RNA-seq和ATAC-seq测序分析，结合已报道的与体胚形成相关的基因，我们初步筛选到了一批可能影响葡萄体胚发生的候选基因，并通过qPCR和基因编辑进行了初步验证，为后续葡萄体胚形成与再生研究提供了参考与基因资源，同时也为揭示控制体胚形成的分子机制奠定了基础。收起

关键词 : 葡萄体细胞胚胎 RNA-seq技术 ATAC-seq技术转录组测序

2. 基于RNA-seq技术筛选驴肌肉发育相关mRNA、miRNA及lncRNA的研究

[学位论文] 李世鹏西北农林科技大学 2020年硕士导师: 党瑞华共108页

摘要 : 骨骼肌是畜禽肉类的重要组成部分，其肌纤维类型是影响肉品质的重要方面，出生前肌纤维数量的增加和出生后肌纤维体积的增大都对肉质和产量有影响。因此，探究骨骼肌发育对于提高肉产量和改善肉品质具有重要的理论意义。越来越多的研究表明非编码RNA(... 展开骨骼肌是畜禽肉类的重要组成部分，其肌纤维类型是影响肉品质的重要方面，出生前肌纤维数量的增加和出生后肌纤维体积的增大都对肉质和产量有影响。因此，探究骨骼肌发育对于提高肉产量和改善肉品质具有重要的理论意义。越来越多的研究表明非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)在调控生物体的胚胎发育、组织分化、器官形成等生命活动扮演着重要的角色，并且对肌肉发育起重要的调控作用。尽管肌肉非编码RNA表达谱在多种动物上已有报道，但马属动物肌肉组织的非编码RNA的表达谱研究仍然较少。驴肉营养价值较高，在中国市场很受欢迎。德州驴是我国著名的优良畜种，其具有体格高大、结构匀称、外形美观、耐粗饲、抗病力强、出肉率高、役肉兼用的特点。为了揭示非编码RNA对驴肌肉发育的调控作用，本研究以德州驴为对象，通过对德州驴不同发育阶段(2月龄和24月龄)骨骼肌转录组进行高通量测序，进而筛选差异表达的mRNA及非编码RNA(lncRNA、miRNA)，然后利用实时定量PCR技术验证测序结果，通过双荧光素酶基因报告系统等方法确定具有重要功能的miR-1的靶基因，以便为肉用驴的选育提供理论依据。主要研究结果如下： 1．德州驴肌肉组织lncRNAs和mRNAs的鉴定及筛选本研究对德州驴两个时期的背最长肌进行lncRNA测序，共鉴定到37004个lncRNAs，筛选到183个差异的lncRNAs和628个差异的mRNAs。功能富集分析发现差异表达mRNA主要功能集中在参与多糖类结合和受体结合及负责能量代谢的AMPK信号通路。通过差异表达lncRNA靶基因预测和验证，发现lnc-008278、lnc-017241、lnc-030153和lnc-033914可能通过调控DCN、ITM2A、MUSTN1和ARRDC2的表达进而影响驴肌肉发育。通过qRT-PCR对mRNA及lncRNA表达量进行验证，发现其定量结果与测序结果基本一致。 2．德州驴肌肉组织miRNAs的鉴定及筛选本研究对德州驴两个时期的背最长肌进行smallRNA测序，共鉴定到536个miRNAs，其中有422个已知的miRNAs，112个新miRNAs，大部分miRNA长度集中在21-23nt，经过差异表达分析发现45个差异miRNAs。对差异miRNA的靶基因进行功能富集分析，发现主要集中在MAPK信号通路、Ras信号通路，这些通路与肌肉发育有关。经miRNA靶基因预测分析，显示novel-204-COL6A2、ADSSL1-miR-370-ARRDC2、miR-125a-3p-MUSTN1和miR-328-PIK3R1等互作方式可能与肌肉发育有关，并通过qRT-PCR证实了以上结果。 3．差异表达miR-1的靶基因的验证通过miRanda预测miR-1靶基因，并成功构建了IGF-1、TMSB4X、EFS1、TPM3、PLXDC2和ZZZ3这6个预测靶基因野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体，经过双荧光素酶报告试验，证实miR-1与TPM3及ZZZ3存在靶向关系。综上，在德州驴的肌肉组织中鉴定到大量的miRNA、lncRNA及mRNA，将为德州驴肉用性能的分子选育提供理论基础。收起

关键词 : 德州驴骨骼肌 RNA-seq技术

3. 基于RNA-seq的肝癌加权基因共表达网络的构建与分析

[学位论文] 赵琼雅温州医科大学 2019年博士导师: 吕建新共101页

摘要 : 研究背景：肝癌是世界上发病率和死亡率最高的癌症之一，在我国，肝癌男性发病率和死亡率均排第二，女性发病率排第六，死亡率排第五。由于肝癌的发生机制复杂，以及缺乏有效的早期诊断标志物和治疗方法，致使肝癌患者的死亡率较高。近年来，肝... 展开研究背景：肝癌是世界上发病率和死亡率最高的癌症之一，在我国，肝癌男性发病率和死亡率均排第二，女性发病率排第六，死亡率排第五。由于肝癌的发生机制复杂，以及缺乏有效的早期诊断标志物和治疗方法，致使肝癌患者的死亡率较高。近年来，肝脏移植、手术切除肿瘤、放疗和化疗方面虽然取得了较大的进展，但肝癌的高复发率使得患者的五年生存率仅有44%。因此，研究肝癌的发生发展机制并寻找肝癌诊断的新型标志物及治疗靶点迫在眉睫。多种组学技术(如基因组、转录组、蛋白质组和代谢组)的不断发展形成了一种新的生物学研究模式，即利用已有的数据信息，通过多组学技术整合生物系统中诸多相互联系和作用的组分来研究复杂的生物过程，深入了解疾病发生的机制。研究目的： 1.基于转录组测序数据和microRNA(miRNA)测序数据，鉴定肝癌组织中的差异表达基因和miRNA； 2.通过差异基因的加权共表达网络分析，鉴定与肝癌临床特征显著相关的基因模块和miRNA模块； 3.通过筛选候选模块枢纽基因，鉴定肝癌中预后相关的关键基因和miRNA，为临床诊断提供帮助； 4.通过关联基因模块和miRNA模块，构建miRNA调控的代谢通路网络，鉴定肝癌中关键信号通路，为探索肝癌的发病机制提供基础。研究方法： 1.基于TCGA数据库GDCDataPortal数据平台以及GTEx数据库获取肝癌的转录组测序数据、miRNA测序数据以及对应样本的临床信息。基于GEO数据库获取用于验证的肝癌转录组测序数据； 2.利用R软件DEseq2分析包和edgeR分析包分别对肿瘤样本与癌旁对照样本间差异性表达的mRNA、miRNA进行分析； 3.利用加权基因共表达网络(Weighted Gene Co-expression NetworkAnalysis, WGCNA)分别构建差异基因的共表达网络和miRNA共表达网络，关联临床样本性状，确定与肝癌病理特征显著相关的候选模块； 4.对于候选基因模块和miRNA模块，基于weight＞0.10分别绘制基因互相作用网络和miRNA互相作用网络，依据连接度筛选前10位为候选枢纽基因,其中连接度最高的为核心基因； 5.基于TCGA数据和验证数据集对候选模块枢纽基因和miRNA绘制表达量热图，鉴定模块分类的稳定性； 6.基于TCGA数据对候选枢纽基因和miRNA进行不同肿瘤分期表达量分析，并绘制箱线图，使用单因素方差分析鉴定与肿瘤分期显著相关的基因和miRNA； 7.对肿瘤分期相关基因和miRNA进行生存分析，并绘制Kaplan-Meier生存曲线，鉴定预后相关的枢纽基因和miRNA； 8.使用GO和KEGG数据库对候选模块基因进行生物学功能注释和信号通路富集； 9.使用STRING数据库得到基因对应蛋白的互相作用关系，构建蛋白-蛋白互作网络，识别蛋白主要功能簇； 10.使用Starbase数据库得到miRNA与基因之间的互作调控关系，预测模块miRNA的靶基因；使用clueGO对预测的靶基因进行KEGG信号通路富集； 11.使用得到的miRNA-gene靶向调控关系构建基因模块与miRNA模块关联的肝癌相关代谢通路网络，明确核心miRNA，并鉴定参与肝癌的主要信号通路。研究结果： 1.通过TCGA数据库检索，共有422例样本，其中包括371例肝癌组织和50例正常组织，收集相对应的转录组测序数据和miRNA测序数据。从GTEx数据库中收集到177例正常肝组织的转录组测序数据。从GEO数据库收集到转录组测序数据集两个，其一编号为GSE124535，包含35例肝癌组织样本和35例对应癌旁组织样本，另一编号为GSE97214，包含9例肝癌组织样本和9例对应癌旁组织样本；另还有一个miRNA测序数据集GSE76903，包含20例肝癌组织样本和20例对应癌旁组织样本； 2.基于R软件的DEseq2和edgeR分析包进行差异表达分析并对结果取交集，共鉴定了5075个差异基因；258个差异miRNA； 3.基于差异基因加权构建共表达网络，共鉴定出24个基因模块，其中blue模块与brown模块与样本类型和肿瘤分期呈显著正相关(R2＞0.4,P＜0.05)，black模块与样本类型和肿瘤分期呈显著负相关(R2＜-0.6,P＜0.05)，将之作为下一步研究的候选模块； 4.根据模块内基因连接度，共选出30个模块枢纽基因，其中SNRPB、COLEC10和RHNO1分别是三个模块的核心基因；表达量热图结果显示，blue模块和brown模块的基因在TCGA数据集和GEO数据集中均呈现肿瘤中高表达，black模块的基因均呈现低表达现象。对核心基因进行多肿瘤表达量研究，结果显示COLEC10在肝细胞肝癌和胆管细胞肝癌中特异性表达量下调； 5.对关键模块blue模块和brown模块中枢纽基因的不同分期表达量分析显示，20个枢纽基因在肝癌不同分期中表达量均呈上升趋势，且单因素方差分析结果具有统计学意义(P＜0.05)；black模块中7个枢纽基因在不同分期中表达量呈下降趋势，单因素方差分析结果具有统计学意义(P＜0.05)； 6.对27个枢纽基因进行生存分析，结果显示有22个基因与预后显著相关(P＜0.05)； 7.基于miRNA数据构建miRNA共表达网络，共鉴定出15个模块，其中turquoise模块与样本类型(r=0.27)和肿瘤分级(r=0.32)呈现显著正相关(P＜0.05)，red模块和yellow模块与样本类型和肿瘤分期呈中等程度显著负相关(R2＜-0.4,P＜0.05)，将之作为下一步研究的候选模块； 8.根据模块内连接度和差异表达，共选出22个模块枢纽miRNA，其中turquoise模块中7个，red模块中10个，yellow模块中5个，核心miRNA分别是miR-877、miR-101-3p和miR-199a-5p。表达量热图结果显示，turquoise模块的miRNA在TCGA数据集和GEO数据集中均呈现肿瘤中高表达，red模块和yellow的miRNA均呈现低表达现象； 9.对22个枢纽miRNA的不同分期表达量绘制箱线图并使用单因素方差分析，结果显示，turquoise模块中有6个miRNA在不同分期中表达量呈显著上升趋势(P＜0.05)；red模块和yellow中分别有1个和1个呈显著下降趋势(P＜0.05)； 10.对8个肿瘤分期相关的枢纽miRNA进行生存分析，结果显示有5个miRNA与预后显著相关(P＜0.05)，分别是miR-1226、miR-301a、miR-1180、miR-501和miR-877； 11.通过GO分析和KEGG信号通路分析，blue模块内的基因主要参与了线粒体相关的生物学过程及信号通路，如ATP合成、线粒体呼吸链复合体组装、线粒体氧化磷酸化等；brown模块的基因主要参与细胞周期、DNA修复、端粒维持、P53等信号通路；black模块的基因主要参与细胞炎症因子相关的信号通路，如JAK-STAT信号通路； 12.使用STRING得到三个基因模块的蛋白-蛋白互作网络，blue模块的蛋白簇主要集中在核糖体蛋白和电子传递链相关蛋白上，brown模块集中在细胞周期和有丝分裂相关蛋白，black模块集中了一些转录因子，如c-JUN、c-FOS、ATF3以及炎症因子和趋化因子，如IL6、CXCL12等，与我们基因的富集结果一致； 13.使用Starbase数据库，turquoise模块枢纽miRNA共得到7593个靶基因，red模块得到4251个靶基因，yellow模块得到3926个靶基因，通路富集分析显示其主要参与细胞生长、p53信号通路、MAPK信号通路等； 14.使用预测的miRNA调控关系构建了基因模块与miRNA模块关联的肝癌相关代谢通路，包含了MAPK信号通路为主的7条相关通路，其中miR-424-5p和miR-195-5p起核心调控作用。研究结论： 1.本研究利用转录组学测序数据和miRNA测序数据，构建了肝癌的基因共表达网络和miRNA共表达网络，鉴定了与肝癌分期和组织类型显著相关的3个基因模块和3个miRNA模块； 2.通过模块内枢纽基因和miRNA分析，鉴定了与预后相关的13个关键基因和5个关键miRNA； 3.miR-199a-3p、miR-877和miR-101-5p是三个miRNA模块中的核心miRNA，SNRPB、COLEC10和RHNO1是三个基因模块的核心基因，且COLEC10在肝癌中呈现特异性表达，可作为下一步分子机制研究的候选基因； 3.GO分析和KEGG通路分析显示肝癌的发生发展主要参与线粒体氧化磷酸化、ATP合成及细胞周期和炎症反应等生物学过程； 4.通过构建miRNA-gene模块关联网络，鉴定了以miR-424-5p和miR-195-5p为核心调控因子的MAPK信号通路为主的7条肝癌相关信号通路。收起

关键词 : 肝癌基因共表达 RNA-seq技术

4. 小麦盐胁迫相关lncRNA的预测与功能分析

[学位论文] 闫艳青岛农业大学 2018年硕士导师: 穆平共83页

摘要 : 盐胁迫严重影响小麦产量，揭示小麦的耐盐分子机理对于解释小麦响应盐胁迫的现象以及培育耐盐性小麦品种具有重要意义。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，植物生长发育及抗逆分子机制研究取得重要进展。长非编码RNA（long non coding RNA， lnc... 展开盐胁迫严重影响小麦产量，揭示小麦的耐盐分子机理对于解释小麦响应盐胁迫的现象以及培育耐盐性小麦品种具有重要意义。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，植物生长发育及抗逆分子机制研究取得重要进展。长非编码RNA（long non coding RNA， lncRNA）是一种重要的调控类RNA，其在植物响应胁迫中发挥重要作用，而其响应胁迫的分子机制还不清楚。为研究lncRNA参与小麦耐盐的作用机制，本研究以耐盐小麦品种小偃60和不耐盐品种鲁麦21为材料，经200 mmol/L NaCl胁迫处理，利用转录组测序技术（RNA-Seq）和生物信息学手段鉴定候选lncRNA并对获得的lncRNA及其靶基因进行功能分析和表达模式分析，主要结果如下： 1.对小偃60（XY）和鲁麦21（LM）测序，结果表明获得序列的50%以上比对到基因间区。根据测序结果并结合生物信息学手段共筛选到746个差异表达lncRNA；其中小偃60有675个，鲁麦21有592个。通过分析RNA染色体分布可知，lncRNA在3B和4B染色体的分布频率较高。 2.lncRNA靶基因预测结果表明，746个lncRNA共获得12 948个trans类靶基因，其中靶基因数目小于50个的lncRNA占比为58%。分析靶基因的GO富集情况，富集到生物过程（BP）的数目最多。小偃60和鲁麦21中分别有564和273个靶标mRNA参与富集度前十的BP中，分别有504和379个lncRNA发挥trans调控作用。KEGG分析共得到44条显著路径，小偃60和鲁麦21分别有25和30条表现显著，其中分别有6和4条与植物响应盐胁迫相关。 @@3.利用qRT-PCR分析5个响应盐胁迫的lncRNA在不同胁迫处理中的表达情况，多数lncRNA在胁迫12 h或24 h时达到表达量的峰值，小偃60根中lnc-693的qRT-PCR结果与测序结果一致。分析5个参与光合作用、物质代谢及氧化磷酸化等路径的lncRNA （包含上述2个lncRNA）及其靶基因在不同组织的表达情况，结果显示lncRNA和靶基因均在小偃60胁迫12 h（XY3）的根中高表达或达到最大表达量，多数基因表现组织和时间特异性。相对保守序列比对结果表明，其中4个有相对保守序列结构。分析lncRNA保守序列的二级结构，其中lnc-184的最低自由能（MFE）最小，其次是lnc-726。lnc-184有多个发夹结构，且碱基配对率较大；lnc-726仅有一个发夹结构，且这个发夹结构配对率为1，稳定性高。 4.得到的746个lncRNA在不同的处理和品种间分布不同，表现胁迫表达特异性， qRT-PCR结果也证明了这一点。这些lncRNA分别参与不同的生物过程和路径。小偃60中的lncRNA通过参与光合作用、氧化磷酸化、黄酮类化合物合成等路径基因的调控来响应盐胁迫，鲁麦21中的lncRNA通过参与物质代谢、物质合成等路径基因的调控来响应盐胁迫。收起

关键词 : 小麦盐胁迫长非编码RNA RNA-Seq技术

5. 脂质代谢在金钱鱼渗透调节中的作用

[学位论文] 陈杰青广东海洋大学 2023年硕士导师: 邓思平共82页

摘要 : 金钱鱼(Scatophagusargus)为广盐性海水硬骨鱼类，能够生活在近海海域，具有洄游并在河口等地进行产卵的繁殖习性。此外，金钱鱼幼鱼在5ppt的咸淡水中比海水中生长更快。但关于金钱鱼为何能够穿梭于咸淡水生活;在低盐环境中生长更快的原因，以及盐度影... 展开金钱鱼(Scatophagusargus)为广盐性海水硬骨鱼类，能够生活在近海海域，具有洄游并在河口等地进行产卵的繁殖习性。此外，金钱鱼幼鱼在5ppt的咸淡水中比海水中生长更快。但关于金钱鱼为何能够穿梭于咸淡水生活;在低盐环境中生长更快的原因，以及盐度影响脂质代谢方面的报道较少。相关研究表明，鱼类脂质与鱼类应对盐度胁迫的能力具有密切联系。为系统的了解脂质代谢相关通路和基因在金钱鱼盐度胁迫下的响应机制。本研究以1龄金钱鱼(体长:16.9-18.9cm,体重:148.1-211.5g)作为实验对象，对金钱鱼在高盐(35ppt)、对照(25ppt)和低盐(5ppt)条件下处理22天的肝脏转录组和脂质代谢相关基因的表达进行分析;分析高渗(600mOsmol/L),对照(300mOsmol/L)和低渗(150mOsmol/L)条件下原代肝细胞的脂质代谢相关基因的表达情况;同时分析miRNA对金钱鱼脂质代谢相关基因的调控作用。本研究所获得的主要结果如下: (1)不同盐度处理后，与对照组相比，低盐处理显著下调了甘油磷脂代谢、甘油脂代谢、类固醇激素生物合成以及类固醇生物合成等脂质代谢相关通路;高盐处理后，脂肪酸代谢、脂肪酸生物合成、过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路、脂肪细胞因子信号通路和不饱和脂肪酸生物合成等等脂质代谢相关通路显著上调。与对照组相比，低盐组中sqle、dhcr7、cyp51a1、ugt2a1、ugt2a2、ugt2b20、ugt2b31、cept1、pla2g4a和ptdss2等脂质代谢相关基因的表达显著下调;高盐组中scd1、fads2、pecr、elovl1、g6pc1、socs1、socs3、adipor2、pck1和pparα等脂质代谢相关基因的表达显著上调。 (2)不同渗透压处理金钱鱼原代肝细胞6h后，RT-qPCR结果显示，与对照组相比，aqp7、aqp11、slc6a6、slc14a1和atp1a1等渗透调节相关基因在高渗和低渗胁迫后均表达上调;脂质代谢相关基因g6pc1、socs1、adipor2、sqle、ugt2b20、dhcr7、cyp51a1、ptdss2和socs3在高渗与低渗胁迫后均表达上调。 (3)结合金钱鱼在体盐度胁迫和离体肝原代细胞非等渗胁迫实验结果，筛选了一批潜在具有调控关系的miRNA-mRNA靶基因关系对，包括miR-75负调控pparα、miR-15a负调控scd1、miR-411负调控srebp1以及miR-103和miR-223负调控fas。对金钱鱼原代肝细胞进行miR-15a过表达(mimic)与沉默(inhibitor)的细胞转染实验结果显示，miR-15a在mimic组表达显著上调，在inhibitor组表达显著降低;而靶基因scd1在mimic组表达显著下调，在inhibitor组表达显著上调，表明miR-15a与scd1基因存在负调控关系。综上所述，肝脏转录组分析表明，盐度胁迫对金钱鱼肝脏脂质代谢相关通路和脂质代谢相关的基因表达具有显著影响;RT-qPCR结果表明，原代肝细胞渗透调节和脂质代谢相关基因均参与了维护细胞非等渗胁迫下的能量稳态和结构稳定;筛选了多个参与调控脂质代谢的候选miRNA基因，其中miR-15a与scd1基因之间存在着负调控的靶向关系。这些结果表明，脂质代谢和miRNA调控脂质代谢相关基因在金钱鱼适应环境盐度变化的过程中具有重要的调控作用，但脂质代谢在金钱鱼环境盐度适应中的调控机理和miRNA在金钱鱼脂质代谢调控中的作用机制仍需进一步研究。收起

关键词 : 金钱鱼脂质代谢 miRNA RNA-seq技术

6. 水稻高阈值低温敏感突变体的遗传分析和定位

[学位论文] 郑姣浙江大学 2020年硕士导师: 凃巨民共79页

摘要 : 水稻(Oryzasativa)是世界上最主要的粮食作物之一，世界上一半人口以水稻为主食。水稻起源于热带和亚热带，对低温非常敏感，低温严重影响水稻的地理分布、生长发育及产量。此外，在水稻任意生长发育时期都可能遭受低温影响，因此，挖掘并利用全生育期... 展开水稻(Oryzasativa)是世界上最主要的粮食作物之一，世界上一半人口以水稻为主食。水稻起源于热带和亚热带，对低温非常敏感，低温严重影响水稻的地理分布、生长发育及产量。此外，在水稻任意生长发育时期都可能遭受低温影响，因此，挖掘并利用全生育期耐冷基因是解决水稻耐冷性的一个重要途径，相关研究对于我国甚至世界水稻生产有着十分重要的意义。本研究以一份籼稻背景的高阈值低温敏感突变体lts(lowtemperaturesensitive)为研究对象，通过F2临时和BC5F2永久群体构建和籍助BSA重测序与图位克隆以及RNAseq转录组分析技术对控制高阈值低温敏感突变体的遗传位点进行了遗传定位，并对定位区间内的候选基因进行了表达验证。主要结果如下： 1.以LJ20（龙粳20，低温抗性粳稻材料）和lts为亲本构建了LJ20/ltsF2定位群体，并利用BSA(BulkedSegregantAnalysis)重测序技术对该群体中两个极端表型的DNA混池进行了测序分析。结果显示：在7号和12号染色体上分别存在1个突变区域，其中，7号染色体的定位区间与前期研究结果一致。另外，本次研究结果和之前的研究结果都证实该突变表型受隐性基因控制。 2.以NB（Newbonnet，广亲和的低温抗性材料）和lts为亲本构建了NB/ltsBC5F2的永久定位群体，并利用分子标记对7号染色体的定位区间进行了精细定位，结果将位于7号染色体上的osltsa定位至SNP13和C61之间的65kb区域，且在定位区间范围内发现有12个预测的基因，对NB和永久定位群体中的近等基因系NBlts比较测序共发现预测的基因上分别有6处SNP差异，其中5个分别位于3个未知基因的内含子上，只有1个相对有意义的SNP的差异发生在预测的一个转座子基因LOC_Os07g04480的5′-UTR上（G-A），该基因没有被报道。因此，将其视作为候选基因，并正在对它的功能进行验证。 3.通过RNA-seq（转录组测序）技术对lts和NBlts近等基因系（H9301）以及NB对照在低温处理前后的转录本进行了测序及基因表达差异分析，在之前的osltsa定位区间,发现LOC_Os07g04930在5′-UTR上存在1处碱基的替换突变，引发了该基因在抗感材料花药组织中的表达量出现巨大差异，虽然在低温处理后该基因在抗感材料中的总体表达量是下调的，但抗感材料间的差异却是显著加大，由原来的24倍加大到1118倍，加大的原因主要是抗性材料的表达量下调的更多。qPCR验证结果显示该基因在抗感材料中的表达量差异和低温处理后的下调趋势与RNA-seq数据基本一致。因此，确定将该基因和前面的LOC_Os07g04480一起处作为osltsa的目标候选基因，后期拟对这2个基因进行功能验证。收起

关键词 : 低温敏感精细定位水稻 RNA-seq技术

7. 梅花冷锻炼调控耐冻性相关基因鉴定及功能研究

[学位论文] 李平北京林业大学 2021年博士导师: 张启翔共178页

摘要 : 低温是限制植物的生长发育及地理分布的重要因素之一。通过冷锻炼来增强耐寒性是植物应对低温胁迫的重要调控策略。相比一年生植物，多年生木本植物耐寒机制更加复杂多样，既存在冷锻炼增强抗性机制又存在休眠保护机制，增加了解析多年生木本植物耐寒... 展开低温是限制植物的生长发育及地理分布的重要因素之一。通过冷锻炼来增强耐寒性是植物应对低温胁迫的重要调控策略。相比一年生植物，多年生木本植物耐寒机制更加复杂多样，既存在冷锻炼增强抗性机制又存在休眠保护机制，增加了解析多年生木本植物耐寒性分子机制的难度。梅花（PrunusmumeSieb.etZucc）作为我国传统名花，兼具经济、观赏和文化价值。研究梅花冷锻炼提高耐寒性的分子机制，有助于培育优良耐寒梅花品种。本研究通过综合评价不同梅花品种冷锻炼处理过程中生理响应的动态差异，确定了梅花关键的冷锻炼处理时间点。通过联合RNA-seq和ATAC-seq分析挖掘了梅花冷锻炼调控耐寒性相关基因，并解析了其分子调控机制。利用分子生物学技术对核心调控基因进行了基因功能和分子调控机制的验证。本研究的主要结果如下：（1）冷锻炼可增加梅花茎可溶性物质的合成和转换速度，冷锻炼时间的延续提高了可溶性物质水平以及激活POD和SOD酶活。可溶性糖含量整体呈现上升趋势，5个品种平均提高2.1倍，''早绿萼''由6.73mg/g增加到12.29mg/g。冷处理9d达到最佳冷锻炼效果，''淡丰后''POD酶活性由181.7U/g增加到411.1U/g，''早绿萼''由167U/g增加到329.5U/g。此外，3个真梅系品种中，''早绿萼''冷锻炼过程生理生化指标综合评价最优，其耐冻性显著增强。（2）冷锻炼增加了梅花冻响应差异表达基因的数量，其中包含MYB、bHLH、NAC、ERF、WRKY、HSF、bZIP和DREB转录因子家族基因。基因表达水平分析表明梅花响应冷、冻以及冷锻炼后冻处理基因整体表达水平存在差异，同时存在部分基因共同响应冷、冻以及冷锻炼后冻处理。在不同低温处理条件下，转录因子家族成员具有不同的表达模式，表明不同转录因子成员响应不同的低温环境。此外，发现91个差异表达基因参与Ca2+信号转导途径、MAPK级联途径、ABA信号转导通路和ICE-CBF信号通路。（3）染色质可及性检测获得梅花全基因组范围的染色质开放区间，结合RNA-seq基因表达谱分析表明基因染色质开放性与表达水平成正相关关系。冷锻炼后冻处理组差异染色质开放区域鉴定到13个motifs，招募7个bZIP、3个TCP、1个ERF、1个Dof和1个C2H2转录因子家族成员。冷锻炼后冻处理组中，冷激蛋白基因（PmCSL）TSS近端-177区域染色质开放程度显著变大，同时基因表达水平显著提高。PmCSL基因-215~-236区检索发现了反式作用因子bZIP结合位点，其开放区域还发现了ERF、WRKY和TCP的结合位点。（4）PmCSL基因编码321个氨基酸序列且具有高度的保守性，含有脱水素结构域。酵母单杂交结果显示，PmERF4/PmbZIP44转录因子可以与PmCSL基因开放区结合；PmERF9.1、PmERF9.6和PmbZIP36转录因子不具备结合PmCSL基因开放区结合的能力。在拟南芥中过表达PmCSL基因，无论在冷锻炼还是非冷锻炼下都能提高转基因植株的耐冻性，并且促进了下游冷相关基因CORs的表达。（5）PmbZIP36和PmbZIP44基因分别编码157和349个氨基酸，表达蛋白亚细胞定位在细胞核上。酵母双杂交显示，PmbZIP36/44基因表达蛋白不具有自激活能力，并且对酵母细胞没有毒性，通过酵母文库筛选PmbZIP36获得到27个潜在的互作蛋白，PmbZIP44获得11个潜在的互作蛋白，其中PmbZIP36和PmbZIP44能形成异源二聚体。PmbZIP44基因不影响拟南芥的基础耐冻性，过表达PmbZIP44基因拟南芥冷锻炼后能提高转基因植株的耐冻性。综上所述，本研究结合RNA-seq和ATAC-seq联合分析阐述了冷锻炼调控梅花耐冻性的分子调控网络，揭示了PmCSL和PmbZIP36/44基因在梅花冷锻炼及耐冻性方面的作用，为今后梅花耐寒育种提供基因资源和理论基础。收起

关键词 : 梅花基因鉴定冷锻炼耐冻性 RNA-seq技术 ATAC-seq技术分子机制

8. 玉米南方锈病抗病基因定位及转录组分析

[学位论文] 戴壮壮河南农业大学 2021年硕士导师: 苟明月共63页

摘要 : 玉米南方锈病是由病原菌多堆柄锈菌引起的一种病害，锈孢子主要依附在叶片部位，引起光合作用减弱，对玉米产量造成很大的损失。该病害主要发生在热带和亚热带地区，近年出现在温带地区蔓延加重的趋势，因此受到广泛关注。利用玉米本身的抗病资源进行... 展开玉米南方锈病是由病原菌多堆柄锈菌引起的一种病害，锈孢子主要依附在叶片部位，引起光合作用减弱，对玉米产量造成很大的损失。该病害主要发生在热带和亚热带地区，近年出现在温带地区蔓延加重的趋势，因此受到广泛关注。利用玉米本身的抗病资源进行抗病育种和品种遗传改良是控制玉米南方锈病流行的有效途径。本研究以抗南方锈病玉米自交系L119A为供体亲本，以感南方锈病玉米自交系Lx9801为轮回亲本，构建BC4F1群体，BC4F1群体自交获得BC4F2。通过自然发病，对BC4F1和BC4F2群体所携带的抗病基因进行了遗传分析。利用卡方(x2)检验，结果表明，在BC4F1群体中，抗病与感病之比为1∶1(x2=0.0022＜3.84，P=0.9624＞0.05)。在BC4F2群体中，抗病与感病之比为3∶1(x2=1.0989＜3.84，P=0.2945＞0.05)，实际分离比例均符合孟德尔遗传定律。因此，我们推测抗病材料L119A存在一个控制南方锈病抗性的主效QTL。本研究利用混合群体分离结合高通量测序(BSA-seq)的方法对BC4F2群体进行抗病基因的初定位。从BC4F2群体中分别选取25株极端抗病和感病材料进行等比例混池，然后进行测序和生物信息学分析。结果显示，参与抗病的基因可能存在于1号、6号、8号和10号染色体上的QTL区段。并在10号染色体上检测到一个高效应值QTL，推测其为控制南方锈病抗性的主效QTL。我们在该候选区间发现两个CC-NBS-LRR类型的抗病（R）基因Zm00001d023265和Zm00001d023267。通过qRT-PCR分析，发现这两个基因在L119A中的表达量均明显高于Lx9801，并且在B73材料的各个组织中均有表达，但叶片中的表达量最高，因此，这两个基因被认为是主要的候选基因。但目前的研究并不能排除其它候选基因。为了系统地了解L119A抗玉米南方锈病的潜在分子机制，我们对抗病自交系L119A和感病自交系Lx9801分别接种多堆柄锈菌，并进行RNA测序(RNA-seq)。结果显示，接种与未接种相比的差异表达基因在L119A中的数量约为Lx9801的10倍，并且仅有29个基因在L119A和Lx9801共同差异表达，这表明在高抗自交系而非高感自交系中存在广泛的基因表达变化。与未接菌相比，其中一个CC-NBS-LRR候选基因在Lx9801和L119A中均被下调。此外，通过基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析表明，转录因子(TF)以及参与防御反应和代谢过程的基因被显著富集，其中苯丙烷类生物合成途径被最显著激活。与此相吻合的是，L119A中的木质素含量，特别是S-木质素的积累在接种后显著增加，但在Lx9801中保持不变，暗示木质素在抗玉米南方锈病中起关键作用。基于以上研究，我们提出了多堆柄锈菌在抗性材料中激活防御反应和代谢变化的调控网络模型。收起

关键词 : 玉米南方锈病抗病基因定位转录组 BSA-seq技术 RNA-seq技术

9. 低镉积累水稻的RNA-seq分析和OsABCG48的过表达研究

[学位论文] 蔡兴喆中国科学院大学 2021年博士导师: 任海；王昌虎共119页

摘要 : 镉(Cadmium，Cd)是一种主要的环境污染物，也是对活细胞毒性最大的重金属元素之一。植物根系可吸收污染土壤中的Cd，进一步运输至种子等可食用部分，从而使其进入食物链，最终对人体造成伤害。水稻作为人类的主粮之一，其Cd污染问题正日益受到人们的重... 展开镉(Cadmium，Cd)是一种主要的环境污染物，也是对活细胞毒性最大的重金属元素之一。植物根系可吸收污染土壤中的Cd，进一步运输至种子等可食用部分，从而使其进入食物链，最终对人体造成伤害。水稻作为人类的主粮之一，其Cd污染问题正日益受到人们的重视。随着与Cd胁迫调控相关研究的不断深入，与Cd抗性相关的基因相继被发现，其中的分子机制逐步被揭开。尽管如此，目前关于水稻中与Cd转运相关蛋白的研究依然相对较少，发掘更多的Cd转运基因相关资源，不仅可以进一步解析植物对抗Cd胁迫的分子机理，也将有助于推动水稻低Cd育种的进程。本实验室的前期研究发现，OXS3家族中的OsO3L2基因的2B片段过表达可以有效降低水稻中Cd的积累。因为OsO3L2基因编码的是一个核定位蛋白，其可能作为一个染色质重塑相关蛋白调控下游基因对Cd胁迫的响应。因此，本研究通过RNA-seq技术鉴定出一系列在野生型和低Cd水稻株系间的差异表达基因，并对其中的多个转运蛋白基因进行分析。结果表明过表达其中一个OsABCG48基因可以显著降低水稻根中Cd的积累。OsABCG48属于ABC(ATPbindingcassette)基因超家族。该家族的部分成员已被证明可以在植物耐受Cd胁迫方面发挥作用。因而OsABCG48有可能作为新的基因资源，促进水稻低Cd育种工作。本研究主要结果如下: 1.在低Cd积累水稻株系2B和野生型水稻中花11号之间，通过对比Cd胁迫处理前后的表达水平变化，总计鉴定出1420个差异基因。其中受Cd胁迫影响的差异基因有791个，而受到基因型效应影响的差异基因则有741个。GO(GeneOntology)和KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)分析揭示了一系列分别响应Cd处理和基因型差异的富集项，其中氧化胁迫相关途径是富集程度最高的生物学途径，显示2B的过表达可能在减轻氧化胁迫方面起重要作用。 2.鉴于目前水稻中鉴定出的Cd积累相关基因多为转运蛋白基因，因此本研究重点关注了8个与转运蛋白相关基因。qRT-PCR的验证表明，其中有5个基因的表达与RNA-seq的数据一致。在裂殖酵母的抗性分析实验中，上述5个候选基因中只有OsABCG48和OsHIPP43能显著增强酵母对Cd的耐受性。 3.将OsABCG48和OsHIPP43这两个基因在拟南芥中异源表达的表型实验显示，只有超表达OsABCG48能显著增强拟南芥对Cd的耐受性，而OsHIPP43不能。 4.随后将OsABCG48转入水稻进行表型分析。结果表明，过表达OsABCG48可以显著提高水稻对Cd的耐受性。过表达OsABCG48株系的根长平均比野生型长12％-17％以上，同时侧根数目和长度都达到对照植株的3倍以上。这些结果说明OsABCG48可以增强水稻对Cd的耐受性，并且能在Cd胁迫条件下促进侧根的发育。 5.苗期Cd积累的分析结果显示，在过表达OsABCG48水稻苗的根中比对照植株累积更少的Cd，Cd含量平均约为对照组的39％到60％，而Cu、Zn和Mn的含量没有显著变化。 6.野生型中，OsABCG48主要在根和叶中表达。结合他人的研究数据，推测其可能在根部发挥作用。在OsABCG48过表达植株中，并未检测到OsO3L2和其它低Cd相关的重要基因（如OsNRAMP5、OsHMA3和OsLCT1）的表达变化，据此推测OsABCG48可能作用在OsO3L2的下游，同时OsABCG48可能不会通过以上3个转运蛋白而引起低Cd表型。综上所述，OsABCG48可能在OsO3L2的下影响低镉累积转基因水稻2B株系中的低Cd累积。初步显示超表达OsABCG48具有降低水稻Cd累积的功能，有望为将来研究水稻低Cd性状形成的机理和水稻低Cd育种提供新的研究材料。收起

关键词 : 镉氧化胁迫水稻 RNA-seq技术 OsABCG48基因

10. 水稻潜在功能性多肽的鉴定及功能预测

[学位论文] 孙彦中国科学院大学 2017年硕士导师: 骆迎峰共83页

摘要 : 植物多肽被认为是植物蛋白质组最小的功能分子，长度一般在2-100个氨基酸之间。它们在植物的生长发育、应激反应及抗病抗虫过程中发挥重要作用。但是植物多肽在基因预测和蛋白质谱分析中仍经常被忽视，多肽总数及种类也随之被低估，因此有必要加强植物... 展开植物多肽被认为是植物蛋白质组最小的功能分子，长度一般在2-100个氨基酸之间。它们在植物的生长发育、应激反应及抗病抗虫过程中发挥重要作用。但是植物多肽在基因预测和蛋白质谱分析中仍经常被忽视，多肽总数及种类也随之被低估，因此有必要加强植物多肽研究。伴随着高通量测序技术的快速发展，高通量、低成本的RNA-Seq为转录本数据的获取提供了保障。通过转录组数据，可以更好地分析基因功能和表达水平。质谱检测是蛋白质组研究的主要技术，而纳升级液相色谱串联质谱技术为多肽组学的研究提供了便利。本研究结合转录组学和多肽组学技术鉴定水稻多肽，并根据多肽的位置和序列保守性，以及多肽所在基因的表达谱特征预测水稻功能性多肽。水稻不仅是重要的粮食作物，更是一种具有广泛理论和应用价值的单子叶模式植物。本研究采用1/2MS培养基恒温育苗的方式获取高质量的实验材料（水稻、玉米三叶期幼苗），并通过RNA-Seq获取根部和叶片的转录组数据。为选取最佳多肽提取方案，本研究分别采用尿素提取法、Tris-饱和酚提取法、蛋白提取缓冲液提取法获取总蛋白，综合比较实验操作复杂度、样品浓度、质谱峰图等内容，最终通过尿素提取法富集10kDa以下的植物多肽。多肽纯化后，采用纳升级液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨率串联质谱仪进行质谱检测，并利用ProteinPilot软件进行多肽鉴定，经数据库检索后，最终选用FDR小于1％的多肽数据。通过多肽序列物种间保守性及对应蛋白功能分析，找到了目标多肽（TARSD）。同时通过与拟南芥RGF1家族多肽保守功能域的多序列比对，确定了内参多肽(REF_SD)，但内参多肽功能在水稻中尚未进行研究。整合水稻和玉米转录组数据及多肽质谱数据，推测目标多肽和内参多肽可以改变水稻根部或叶片表型。通过化学合成多肽的梯度外施实验，证明REFSD多肽可以抑制水稻根和幼苗生长，并引起水稻根部的加粗。本研究建立了实验苗培育、多肽提取、质谱鉴定到功能研究的流程，发现1800多个水稻多肽，并通过比较相同组织发育时期玉米多肽谱数据，发现数个水稻和玉米间的位置和序列保守性多肽，成功探究REFSD多肽对水稻幼苗生长的作用，表明整个研究从实验设计到实际操作基本可行，为后续研究水稻潜在功能性多肽奠定基础。收起

关键词 : 植物多肽水稻 RNA-Seq技术功能验证