中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 王蕾延边大学 2023年硕士导师: 郑昌吉；崔然吉共56页

摘要 : 目的:抑郁症已成为全世界的影响人类健康的危险因素之一，备受全社会的关注。而对于抑郁症的治疗，现如今临床上所使用的药物效果不理想，副作用较大，并且严重影响患者的身体和生活质量。因此，开发安全低毒性的新药已然成为研究工作者的工作核心。芍... 展开目的:抑郁症已成为全世界的影响人类健康的危险因素之一，备受全社会的关注。而对于抑郁症的治疗，现如今临床上所使用的药物效果不理想，副作用较大，并且严重影响患者的身体和生活质量。因此，开发安全低毒性的新药已然成为研究工作者的工作核心。芍药苷是从芍药或牡丹根部提取的，是一种低毒性草药，广泛用于抑郁症的治疗。一些含芍药苷的药物已在临床上被应用于抑郁症的治疗，比如逍遥散，柴胡疏肝散等。迄今为止，芍药苷的抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗凋亡或神经保护作用已被证实，然而，近年来人们越来越重视芍药苷的抗抑郁作用。因此，本研究使用低剂量利血平诱导的抑郁模型探究芍药苷对抗抑郁的改善作用及其机制。方法:实验使用60只ICR雄性小鼠，按照随机分组原则分成六组，每组10只:实验组（Control）,利血平模型组（RESP）,利血平+氟西汀组（FLXT）,利血平+芍药苷10mg组（PF10mg），利血平+芍药苷30mg组（PF30mg）,利血平+芍药苷90mg组（PF90mg）。小鼠适应三天环境后，用利血平反复给药14天建构抑郁模型，最后一天给药后四小时，通过行为药理学实验，包括旷场实验、强迫游泳实验和悬尾实验，探究芍药苷连续给药14天对小鼠抑郁样行为的作用。行为学试验后对小鼠进行断头处理，提取前额叶皮质和海马组织。用Western Blot法测定CREB、p-CREB、ERK、p-ERK、TrkB和BDNF的表达量。结果:1、利血平反复给药14天（0.2mg/kg,i.p.）,诱导了小鼠体温下降和眼睑下垂（P＜0.0001）,小鼠旷场水平运动量（P＜0.0001）和竖直运动量（P＜0.001）都有所下降，延长了小鼠强迫游泳不动时间（P＜0.0001）和悬尾不动时间（P＜0.0001）,利血平连续给药14天降低了CREB蛋白的表达，增加了CREB蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）,降低了ERK蛋白的表达（P＜0.01）,降低了BDNF蛋白的表达。2、芍药苷90mg反复给药14天（i.p.）对小鼠自发运动量无影响。芍药苷90mg反复给药14天逆转了利血平诱导的小鼠眼睑下垂，缩短了小鼠强迫游泳不动时间（P＜0.0001）和悬尾不动时间（P＜0.0001）,芍药苷90mg/kg反复给药升高了CREB蛋白表达水平（P＜0.01）,逆转了CREB蛋白的磷酸化水平（P＜0.01）,升高了ERK蛋白表达水平（P＜0.0001），降低了ERK蛋白磷酸化水平（P＜0.001）,升高了BDNF蛋白的表达。结论:利血平连续给药14天能够显著性诱发小鼠的抑郁样行为的发生，并明显抑制ERK-CREB-BDNF信号通路的活性。而进一步研究显示芍药苷14天连续给药能够显著降低利血平诱导的抑郁样行为的发生，这种改善作用与ERK-CREB-BDNF信号通路的活化具有密切关系。收起

关键词 : 芍药苷实验药理抗抑郁作用 ERK-CREB-BDNF信号通路

2. 大鼠抑郁症模型在7T MRI的脑成像研究

[学位论文] 张薇山东大学 2019年博士导师: 王滨共208页

摘要 : 研究背景: 抑郁症(Depression)是一种常见的精神疾病，主要表现为人类高级认知功能紊乱，心境抑郁，伴有相应的思维语言和精神运动障碍。抑郁症具有复发性和慢性化倾向，自杀率高，严重危害人类身心健康。根据世界卫生组织(WHO)相关材料信息可知... 展开研究背景: 抑郁症(Depression)是一种常见的精神疾病，主要表现为人类高级认知功能紊乱，心境抑郁，伴有相应的思维语言和精神运动障碍。抑郁症具有复发性和慢性化倾向，自杀率高，严重危害人类身心健康。根据世界卫生组织(WHO)相关材料信息可知，当我国社会发展到2030年时，所有高负担疾病中位居第一名的病症即抑郁症，因此对抑郁症相关内容进行分析和研究具有重要意义，例如抑郁症临床治疗、抑郁症发病机制等。由于在人体研究抑郁症组织标本不易获得，有很多局限性，随着科技不断进步和发展，人们尝试利用动物模型对该疾病的病理以及生化等内容进行分析，从而明确导致人类患抑郁症的根本原因与发病机理。脑影像学的发展可从脑结构和功能以及神经物质代谢等方面进一步认识抑郁症发病机制。 7.0T小动物磁共振，可以在活体下、反复、无创、动态观测脑结构、功能等改变，在一定程度上为研究抑郁症发病机制提供了诸多帮助，成为现阶段分析脑功能代谢、脑组织结构的核心影像学手段。很多学者通过研究发现，抑郁症与执行认知和情绪功能的脑区有关，主要集中在皮质和边缘系统。近些年国内外很多学者利用磁共振成像技术从不同的角度显示了静息态或任务态抑郁症患者各脑区形态、结构、功能、代谢等与正常人群有很大差异，取得了一些有意义的研究结果。利用7.0T小动物专用磁共振进行抑郁症脑成像研究的报道尚不多，且多局限于某一结构或功能的研究。而且大脑的神经网络十分复杂，过去的研究认为抑郁症的发病机制与神经内分泌和神经调节功能的紊乱有关，而近些年来的研究多从细胞分子水平上探讨抑郁症的发病机制，逐渐超越了传统的神经生化方面的研究。虽然这些研究从多个角度揭示抑郁症可能的发病机制，提供了一些理论依据，但在精神疾病领域，抑郁症的发病机制较为复杂，还不能全面的阐释抑郁症发生、发展过程中的各种现象，而且与抑郁症发病相关的信号通路有很多，这些信号通路也存在一定的关联性，这些信号转导通路的变化和神经因子的变化，也越来越受到学者的关注。因此，将磁共振多模态成像与组织学分析联合起来对抑郁症的发病机制进行系统性的研究十分有必要。研究目的: 抑郁症的发生机理十分复杂，与应激有密切关系，长期慢性的应激刺激会使海马和前额叶皮质等脑区的神经元细胞出现损伤和凋亡，促进这些脑区神经元损伤的修复和再生也是治疗抑郁症的关键所在。本研究采用建立配合孤养的慢性温和不可预知应激动物模型，应用7.0T小动物磁共振，以海马和前额叶皮质为感兴趣区，通过MRS和DTI图像采集和数据分析，观察抑郁症大鼠模型神经代谢物的变化与脑内纤维束的变化;并进行脑组织BDNF、P-ERK、P-CREB、ERK、CREB蛋白表达的检测分析，观察在BDNF/ERK/CREB信号通路上，慢性应激抑郁模型大鼠海马和前额叶皮质的BDNF、P-ERK、P-CREB的蛋白表达情况。然后将磁共振检测的异常改变与BDNF/ERK/CREB信号通路上目标蛋白的异常变化进行对照分析，从而更好地理解和阐释抑郁症的发病机制，为治疗和预防抑郁症以及抗抑郁药物的研发提供新思路，为临床提供可靠的基础实验数据。研究方法: 1.大鼠抑郁症模型的制备及行为学评价:将实验动物随机分成对照组和模型组两组。以慢性温和刺激，配合孤养建立慢性应激动物模型，包括噪音、频闪光照、杂物、禁食、禁水、夹尾、45。倾斜、垫料异味等刺激，每种刺激随机给予，每周1次，7天为一个周期，共6个周期。6周后观察模型鼠的外观和精神状态并进行模型的糖水偏爱实验，旷场实验的行为学评价。 2.配合孤养的慢性不可预知温和应激大鼠抑郁症模型(GUMS)在7T小动物磁共振成像:配合孤养的CUMS模型复制成功后，分别进行小动物磁共振成像及图像分析。模型组和对照组分别采用7.0T小动物磁共振扫描仪(70/20 PharmaScan，Bruker Biospin GmbH，Germany)进行图像采集。采用TuberRARE序列在水平位、冠状位、矢状位三个平面上分别进行T2加权成像(T2WI)采集;应用1HPRESS序列采集MRS波谱;选择DTI_EPI_seg_30dir进行DTI图像采集。然后进行图像处理和分析。(1)运用扩散张量成像(DTI)进行脑组织形态结构分析:应用ImagingandProcessing5.0软件分析模型组和对照组的双侧海马和前额叶皮质FA值和MD值，并进行图像重建制作伪彩图和纤维示综图。(2)运用磁共振波谱(MRS)进行脑功能代谢分析:应用Topspin5.0软件形成NAA、Glu、Cho、MI、Cr的谱峰，基线校正后并在此基础上测量NAA/Cr、Glu/Cr、Cho/Cr、MI/Cr的比值。 3.运用免疫组化染色显示双侧海马、前额叶皮质脑源性神经营养因子(BDNF)、磷酸化转录因子环磷腺苷反应元件结合蛋白(P-CREB)和磷酸化细胞外信号调节激酶(P-ERK)的蛋白表达情况。对照组和模型组大鼠经心灌注生理盐水100ml固定后断头取脑，放入10％甲醛溶液保存，按照免疫组化染色的实验步骤脱水包埋、漂片、脱蜡水化、冲洗、孵一抗孵二抗、复染，最后封片，用彩色病理图像分析系统测量目标蛋白的阳性面积光密度值。 4.运用Westernblot法检测双侧海马、前额叶皮质脑源性神经营养因子(BDNF)、磷酸化转录因子环磷腺苷反应元件结合蛋白(P-CREB)和磷酸化细胞外信号调节激酶(P-ERK)的蛋白表达情况。将对照组和模型组大鼠处死取出脑组织，在蛋白抽提和蛋白调整后，按照WesternBlot常规实验方法进行制胶、上样、电泳、转膜、封闭、孵一抗、洗膜、孵二抗，最后曝光后获取目标蛋白条带进行分析和灰度值测量。 5.影像学与组织学对照分析:观察分析模型组双侧海马和前额叶的MRS和DTI观察指标与相应脑组织的目标蛋白BDNF、P-ERK和P-CREB变化是否有一致性或相关性。研究结果: 1.大鼠抑郁症模型的制备及行为学评价结果:造模后，模型组大鼠外观和精神状态与对照组比较明显改变，糖水偏爱实验显示模型组大鼠糖水消耗显著减少(P＜0.01)。旷场实验显示模型组大鼠中心区域运动距离、中心区域活动时间和移动速度与对照组相比显著下降(P＜0.05，P＜0.01)。 2.MRS结果:与对照组相比，模型组大鼠双侧海马和左侧前额叶皮质中NAA/Cr、Cho/Cr、Glu/Cr的比值显著下降(P＜0.05)，右侧前额叶皮层NAA/Cr明显减少(P＜0.05)。与对照组相比，模型组右侧前额叶皮层中Cho/Cr、Glu/Cr的比值与模型组大鼠双侧海马和双侧前额叶皮质MI/Cr比值无显著性差异(P＞0.05)。 3.DTI结果:与对照组相比，模型组双侧海马和双侧前额叶皮质中FA值显著下降(P＜0.05);与对照组相比，模型组左侧海马和左侧前额叶皮质中MD值显著升高(P＜0.05)。模型组右侧海马和右侧前额叶皮质中MD值与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。 4.免疫组化结果:模型组双侧海马和双侧前额叶皮质中的蛋白BDNF、P-ERK和P-CREB与对照组相比均显著下降(P＜0.05，P＜0.01)。模型组左侧海马ERK和CREB蛋白表达与对照相比有显著性差异(P＜0.05)。模型组右侧海马和双侧前额叶皮质的ERK、CREB蛋白与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。 5.WesternBlot结果:模型组双侧海马和双侧前额叶皮质的蛋白BDNF、P-ERK和P-CREB表达和ERK、CREB蛋白表达与对照组相比均显著下降(P＜0.05，P＜0.01)。与对照组相比有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。 6.影像学与组织学对照分析:MRS和DTI的观察指标与相应脑组织的BDNF/ERK/CREB信号通路的目标蛋白表达有一致性，其中模型组的Glu/Cr与BDNF有正相关关系。研究结论: 1.慢性温和不可预知性应激并配合孤养的抑郁症大鼠模型能够模拟人类在应激刺激作用下的行为学特征，抑郁症模型复制成功。 2.海马和前额叶皮质是抑郁症研究的重要脑区，小动物磁共振显示抑郁症大鼠模型海马、前额叶皮质的神经代谢物有不同程度的改变和纤维束的损伤，而且大脑半球间变化存在不平衡性。 3.抑郁症大鼠模型的海马和前额叶皮质BDNF/ERK/CREB信号通路受到抑制，由此可见此信号通路在抑郁症发病机制中有重要作用，是抗抑郁治疗的重要靶点。 4.小动物磁共振多模态成像技术可以很好的观察抑郁症大鼠的脑内结构和功能代谢变化，且检测指标与相应脑组织的信号通路目标蛋白结果有一致性，可以推测模型鼠的MRS和DTI的改变与BDNF/ERK/CREB信号通路活性受到抑制有关。 5.谷氨酸能系统在抑郁症发病机制中确实发挥了关键作用，Glu/Cr能体现组织中谷氨酸能系统与BDNF的相关关系，进而对BDNF/ERK/CREB信号通路活性造成影响，进一步证实MRS在抑郁症诊断与病情监测中可以发挥重要作用。收起

关键词 : 抑郁症动物实验磁共振成像 BDNF/ERK/CREB信号通路

3. Tanshinone ⅡA通过激活ERK-CREB-BDNF信号通路改善小鼠抑郁样行为

[学位论文] 路家琦苏州大学 2018年硕士导师: 徐兴顺共63页

摘要 : 研究背景：抑郁症是由遗传因素和环境因素共同导致的神经心理疾病，临床表现有精力减退、心境低落、认知功能损伤等，严重者甚至出现自杀行为。虽然对于抑郁症的研究越来越深入，但并没有一种理想的抗抑郁药，且长期大量的服用合成类抗抑郁药物... 展开研究背景：抑郁症是由遗传因素和环境因素共同导致的神经心理疾病，临床表现有精力减退、心境低落、认知功能损伤等，严重者甚至出现自杀行为。虽然对于抑郁症的研究越来越深入，但并没有一种理想的抗抑郁药，且长期大量的服用合成类抗抑郁药物会导致诸多不良反应。近来中药治疗抑郁症越来越受到临床医生以及科研者的重视，丹参酮IIA具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等功能，常用于心脑血管疾病的治疗。研究显示丹参酮IIA对阿尔兹海默症、脑缺血方面也有显著的保护作用；但是丹参酮IIA是否具有抗抑郁的作用并不清楚。本课题主要研究丹参酮IIA对于原发性抑郁症的抗抑郁作用及其机制的探究。研究方法：实验动物进行空间行为限制，采用悬尾实验和强迫游泳行为学实验检测小鼠表现出抑郁样行为，蛋白检测：Western, Q-PCR。研究结果：将ICR小鼠进行三周的空间行为限制，悬尾实验和强迫游泳行为学检测小鼠有抑郁样行为；给予丹参酮IIA处理后，丹参酮IIA可以显著减少小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间，提示丹参酮IIA具有抗抑郁的作用。丹参酮IIA处理后的抑郁模型小鼠脑组织以及地塞米松诱导的细胞应激模型中， ERK-CREB-BDNF信号通路相关蛋白表达明显升高，同时丹参酮IIA处理后小鼠的 BDNF mRNA的表达水平也明显升高；然而给予ERK的抑制剂SL327显著降低了ERK-CREB-BDNF信号通路相关蛋白的表达，同时阻断了丹参酮IIA的抗抑郁作用。研究结论：研究表明丹参酮IIA具有良好的抗抑郁作用，其抗抑郁机制是通过激活ERK-CREB-BDNF信号通路来发挥作用的，为丹参酮IIA在抑郁症的临床治疗提供了理论基础，由于丹参酮IIA副作用小，因此有希望成为临床治疗抑郁症的高效药物。收起

关键词 : 抑郁症丹参酮IIA ERK-CREB-BDNF 动物实验信号通路

4. 博尔纳病毒调节ERK-CREB-BDNF信号通路导致大鼠成年后焦虑样及自闭症样行为

[学位论文] 李晨梦重庆医科大学 2018年硕士导师: 谢鹏共64页

摘要 : 背景：Borna病病毒（BDV）是一种嗜神经的、非溶细胞的 RNA病毒，属于单分子负链RNA病毒目属的博尔纳病毒科。其主要特征是持续感染多种脊椎动物的中枢神经系统（CNS），引起动物的神经疾病，导致行为障碍。过去十年来，尽管人类精神疾病的发病机制与... 展开背景：Borna病病毒（BDV）是一种嗜神经的、非溶细胞的 RNA病毒，属于单分子负链RNA病毒目属的博尔纳病毒科。其主要特征是持续感染多种脊椎动物的中枢神经系统（CNS），引起动物的神经疾病，导致行为障碍。过去十年来，尽管人类精神疾病的发病机制与BDV之间的关系仍然存在争议，但是大量的资料显示BDV与人类精神疾病具有高度的相关性。各种神经精神疾病中如：焦虑，孤独症，精神分裂症，重性抑郁症等是常见的危及生命的疾病。并且越来越多的证据表明精神障碍和 BDV引起的动物疾病的发病机制可能是密切相关的。迄今为止，已报道的BDV引起疾病的病例机制包括T细胞介导的细胞毒性，小胶质细胞介导的细胞因子神经毒性，以及多巴胺能、GABA能和谷氨酸能系统的紊乱。尽管如此，BDV致病的具体机制仍然是未知的。 Strain-V是一种博尔纳病毒的实验株，来源于马，接种至兔子体内繁殖所得。 BDV Hu-H1是1996年由德国科学家从情绪障碍患者外周血单个核细胞中分离出来的一种BDV人类病毒株。在我们之前的研究中，基于这两株菌株的研究表明，Hu-H1，而不是Strain-V，可抑制人少突神经胶质细胞（OL细胞）增殖并促进此细胞凋亡。体外研究的不同结果显示这两种病毒株不同的生物学特性。此外，BDV Hu-H1感染人OL细胞导致Raf/MEK/ERK信号通路的显著紊乱。与此一致的是BDV CRP4病毒株可使PC12细胞中ERK1/2信号持续激活，损害神经元分化。并且BDNF诱导的ERK1/2磷酸化可被感染了BDV的神经元所阻遏，而 TrkB受体合成不受影响。所有上述研究均在体外进行实验，缺乏体内研究。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导途径家族的Raf/MEK/ERK信号级联反应与多种神经元细胞增殖，分化，生长和凋亡过程以及许多RNA病毒的激活有关。ERK-CREB-BDNF通路也参与了重度抑郁症、焦虑症、自闭症的病理生理过程，本文旨在验证BDV与情绪障碍之间的关系。目的：在此，我们研究两种不同的Borna病毒株（BDV Hu-H1和BDV Strain-V）在体内和体外调节ERK-CREB-BDNF信号通路，影响的神经元改变后对动物行为学的改变，为进一步研究人类精神疾病提供实验依据。方法：在本研究中，我们在SD大鼠出生24小时内，将Borna病病毒Hu-H1和V株分别经左侧侧脑室注射至大鼠颅内。养至成年后，通过糖水偏好测试，旷场实验，高架十字迷宫和强迫游泳测试来进行相关表型的鉴定。Western Blot检测ERK-CREB-BDNF信号通路蛋白在体内和体外的表达水平变化。结果：出生后第1天（P1）接种 BDV的大鼠，第八周时在 OPT和EPM中的活动度及探索行为显著降低，表明Hu-H1可能引起焦虑样症状。OPT，EPM和FST的结果表明Strain-V感染的大鼠表现出类似自闭症的行为。此外，在两种病毒株感染的大鼠海马组织样品与对照组相比，我们发现 p-44/42MAPK的蛋白表达水平显着上调。ERK-CREB-BDNF信号通路中其他分子的蛋白水平的表达呈上升趋势（p-MEK1/2，p-CREB，CREB和BDNF）。与体内变化不同的是分别感染两种病毒时，原代海马神经元中p-MSK1的蛋白表达水平减弱。结论：综上所述，我们的研究结果表明 Borna病病毒 Hu-H1和Strain-V病毒感染后的新生大鼠在成年后可导致行为异常出现焦虑样或自闭症行为，发病机制与ERK-CREB-BDNF分子信号级联通路相关，这将为研究人类精神疾病的致病机理提供一个新的方向。收起

关键词 : 博尔纳病毒 ERK-CREB-BDNF信号通路自闭症样行为焦虑样行为

5. 噻拉嗪对大鼠脑神经系统PKA、ERK1/2/CREB/BDNF信号通路影响的研究

[学位论文] 李丽娜东北农业大学 2018年硕士导师: 高利共79页

摘要 : 本试验以雄性Wistar大鼠为研究对象，给予噻拉嗪麻醉，通过测定大鼠不同脑区不同麻醉时期的PKA、ERK1/2/CREB/BDNF信号通路中的相关蛋白及基因表达的变化，探讨噻拉嗪麻醉的作用机理。试验选取35只雄性Wistar大鼠，分成对照组(C)和麻醉组(X)，麻... 展开本试验以雄性Wistar大鼠为研究对象，给予噻拉嗪麻醉，通过测定大鼠不同脑区不同麻醉时期的PKA、ERK1/2/CREB/BDNF信号通路中的相关蛋白及基因表达的变化，探讨噻拉嗪麻醉的作用机理。试验选取35只雄性Wistar大鼠，分成对照组(C)和麻醉组(X)，麻醉组又被随机分为6组(n=5):诱导组(X1)、翻正反射消失0 min组(X2)、翻正反射消失30 min组(X3)、翻正反射消失60 min组(X4)、翻正反射恢复0 min组(X5)和翻正反射恢复30 min组(X6)。对照组大鼠在注射生理盐水8 min后，麻醉组在注射噻拉嗪（70 mg/kg）各个时间点之后，立即断头处死大鼠并取脑组织，利用RT-PCR方法检测GluR1、GluR2、ERK1/2、PKC、PKA、CREB、c-jun、c-fos、fos-B和BDNF的mRNA表达;Western blot方法检测GluR1、GluR2、ERK1/2/p-ERK1/2、PKA/p-PKA、PKC/p-PKC、CREB/p-CREB和BDNF的蛋白表达。利用ATP酶试剂盒测定ATP酶的活性，通过ELISA试剂盒测定cAMP的含量。通过这些指标的变化分析，探讨噻拉嗪麻醉对大鼠不同脑区及神经元所产生的影响与PKA、ERK1/2/CREB/BDNF信号通路的关系。试验结果如下: (1)组织实时定量PCR试验结果显示，与对照组比较，GluR1在大脑和海马中显著下降;GluR2和ERK1/2在大脑中显著下降;PKC在各脑区均无明显变化;PKA在海马和丘脑中下降明显;CREB在丘脑和脑干中下降明显。c-jun、fos-B、c-fos和BDNF在各脑区均有明显下降(P＜0.05)。 (2)细胞实时定量PCR试验结果显示，ERK1/2的mRNA表达量:K组、ERK1/2i组与C组比较差异显著(P＜0.05)。PKA的mRNA表达量:K组、PKAi组与C组比较差异显著(P＜0.05)。CREB的mRNA表达量:各组与C组比较均无明显的差异（P＞0.05）。c-jun、c-fos、fos-B、BDNF的mRNA表达量:K组、ERK1/2i组、PKAi组与C组比较差异显著(P＜0.05)。 (3)组织Western blot试验结果显示，与C组比较，p-CREB、GluR1、p-ERK1/2和p-PKA在各脑区内均有明显变化（P＜0.05）;CREB在小脑、海马、丘脑和脑干下降明显(P＜0.05);GluR2在大脑、丘脑和脑干中下降明显，GluR2在小脑中显著升高;ERK1/2在大脑、小脑和脑干中下降明显;PKA在海马和丘脑中下降明显;PKC和p-PKC在各脑区内均无明显的变化;BDNF在各脑区均有明显下降（P＜0.05）。 (4)细胞Western blot试验结果显示，ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达量:K组、ERK1/2i组与C组比较差异显著（P＜0.05）。PKA、CREB、p-CREB、BDNF的蛋白表达量:K组、ERK1/2i组、PKAi组与C组比较差异显著(P＜0.05)。p-PKA的蛋白表达量:K组、PKAi组与C组比较差异显著(P＜0.05)。 (5) Na+-K+-ATPase活性在大脑、海马、丘脑和脑干内明显下降（P＜0.05）。 (6) Ca2+-Mg2+-ATPase活性在五个脑区内均明显下降（P＜0.05）。 (7) cAMP的含量在五个脑区内均明显下降(P＜0.05)。结果表明: (1)噻拉嗪通过影响神经系统AMPA膜受体、CREB蛋白通路和c-fos、 fos-B、c-jun和BDNF基因转录，使机体处于麻醉状态。 (2) ERK1/2和PKA能够调节CREB的表达量，并且影响CREB下游指标，表明噻拉嗪是通过抑制CREB通路对大鼠产生麻醉效果。 (3)在大鼠大脑、小脑和海马内ERK1/2/p-ERK1/2、PKA/p-PKA、CREB/p-CREB、c-jun、c-fos、fos-B和BDNF指标变化明显，表明噻拉嗪对大鼠麻醉是通过影响以上相关因子的表达以及它们之间的级联反应达到麻醉效果的。收起

关键词 : 噻拉嗪动物模型神经系统麻醉作用 ERK1/2/CREB/BDNF信号通路

6. BDNF-ERK-CREB信号通路在PFOS神经毒性中的作用及机制探讨

[学位论文] 李武南华大学 2016年硕士导师: 曾怀才共84页

摘要 : 目的：探索PFOS致SH-SY5Y细胞的毒性作用及其机制，为进一步PFOS神经毒性的研究提供实验依据。方法：实验分为对照组（0μM）和 PFOS剂量组（1、10、50、100、150和200μM），通过CCK8法检测不同浓度PFOS对人源神经母瘤细胞（SH-SY5Y细胞）活性... 展开目的：探索PFOS致SH-SY5Y细胞的毒性作用及其机制，为进一步PFOS神经毒性的研究提供实验依据。方法：实验分为对照组（0μM）和 PFOS剂量组（1、10、50、100、150和200μM），通过CCK8法检测不同浓度PFOS对人源神经母瘤细胞（SH-SY5Y细胞）活性的影响及其时效关系；AO/EB双重荧光染色和Annexin-V FITC/PI双染法分析PFOS对SH-SY5Y细胞凋亡形态和凋亡率的影响；紫外和荧光分光光度法检测 PFOS对SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的影响；QPCR检测PFOS对SH-SY5Y细胞miRNA（has-miR-16和has-miR-22）表达水平以及BDNF、ERK1/2、CREB、DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因mRNA转录水平的影响；Elisa方法检测SH-SY5Y细胞上清液BDNF蛋白水平；Western Blot方法检测PFOS对SH-SY5Y细胞TrkB、ERK1/2、pERK1/2、CREB、pCREB、DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白表达水平的影响。结果：CCK8实验结果显示各浓度PFOS作用于SH-SY5Y细胞24h和48h后，细胞活性呈染毒时间和染毒剂量依赖性下降。将不同浓度的PFOS染毒SH-SY5Y细胞48h后，经AO/EB双重荧光染色和Annexin-V FITC/PI双染法流式细胞术检测，两者结果均显示SH-SY5Y细胞凋亡比例随着 PFOS染毒浓度的上升而增加。紫外和荧光分光光度法结果显示PFOS引起SH-SY5Y细胞中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽还原酶（GSH）水平下降，与对照组相比，最高剂量组 PFOS引起 SOD含量从8±0.12nmol/mg蛋白降至5.89±0.9nmol/mg蛋白；同时引起总活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）水平上升，与对照相比，最高剂量组 PFOS引起 MDA含量从1.92±0.17nmol/mg蛋白显著上升至6.95±0.26nmol/mg蛋白。QPCR和Western Blot结果显示PFOS干扰了BDNF-ERK-CREB信号通路，与对照组相比，在100μM PFOS剂量组中SH-SY5Y细胞上清液中BDNF蛋白水平由60±1.2ng/mL下降至29±1.5ng/mL;并且可能与SH-SY5Y细胞中has-miR-22水平上调有关；同时PFOS也干扰了甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达水平。结论： 1. PFOS染毒显著降低了SH-SY5Y细胞活性；诱导了SH-SY5Y细胞产生凋亡，并呈时间剂量依赖关系。 2. PFOS干扰了 BDNF-ERK-CREB信号通路，这可能与has-miR-22表达水平上调有关，并且这是PFOS神经毒性的机制之一。 3. PFOS对SH-SY5Y细胞产生了氧化应激损伤，并且改变了甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达水平，这也可能是PFOS神经毒性机制。收起

关键词 : 全氟辛烷磺酸钾 SH-SY5Y细胞 BDNF-ERK-CREB信号通路氧化应激神经毒性

7. DEHP青春前期暴露致雄性幼鼠焦虑和抑郁样行为的信号通路研究

[学位论文] 张凡华中科技大学 2019年硕士导师: 石年;李涛共70页

摘要 : 目的：建立幼鼠DEHP青春前期暴露的整体动物模型，观察幼鼠焦虑和抑郁样行为的变化，从病理变化、氧化应激反应、GABA信号通路和ERK1/2-CREB信号通路着手，初步探讨DEHP青春前期暴露的神经毒作用机制。方法：建立整体动物模型：3 周龄雄性 SD 幼... 展开目的：建立幼鼠DEHP青春前期暴露的整体动物模型，观察幼鼠焦虑和抑郁样行为的变化，从病理变化、氧化应激反应、GABA信号通路和ERK1/2-CREB信号通路着手，初步探讨DEHP青春前期暴露的神经毒作用机制。方法：建立整体动物模型：3 周龄雄性 SD 幼鼠（SPF 级）分为两个实验组：实验一组80只幼鼠按体重随机分为溶剂对照组、1、10、50、200mg/kg/d DEHP剂量组；实验二组50只幼鼠按体重随机分为溶剂对照组、低剂量对照组（1mg/kg/d DEHP）、低剂量干预组（1mg/kg/d DEHP+1mg/kg/d Muscimol）、高剂量对照组（200mg/kg/d DEHP）和高剂量干预组（200mg/kg/d DEHP+1mg/kg/d Muscimol）。连续染毒21天。选用旷场实验、高架十字迷宫实验和强迫游泳实验观察幼鼠焦虑和抑郁样行为表现。处死幼鼠后，检测血清生化指标、Nissl 染色观察海马病理变化，检测大脑皮层MDA水平和SOD活力，免疫组化法、Western blot法检测幼鼠海马GABAARα2、GAD65+67、ERK1/2、CREB、p-ERK1/2和p-CREB表达水平。结果： 1.行为学改变：（1）一般行为：各组幼鼠一般情况良好，进食、饮水未见异常。（2）强迫游泳实验：与对照组相比，1mg/kg/d剂量组幼鼠游泳不动时间明显升高，200mg/kg/d剂量组雄鼠休息次数显著降低（P＜0.05）；（3）旷场实验：与溶剂对照组相比，高剂量对照组中心路程和探索时间显著减少，低剂量干预组和高剂量干预组总路程明显升高，各剂量组修饰次数明显减少（P＜ 0.05）；与高剂量对照组相比，高剂量干预组总路程、中心路程和探索时间明显升高（P＜0.05）。（4）高架十字迷宫实验：与溶剂对照组相比，低剂量对照组和高剂量对照组幼鼠进入开臂的次数和开臂路程显著降低，高剂量对照组在开臂中停留的时间比和总路程明显降低，高剂量干预组进入闭臂的次数明显降低（P ＜0.05）；与低剂量对照组相比，低剂量干预组开臂路程明显升高（P ＜ 0.05）；与高剂量对照组相比，高剂量干预组进入开臂的次数、开臂路程和总路程明显升高（P ＜ 0.05）。 2.一般毒性：（1）实验一组：染毒21天10mg/kg/d 剂量组幼鼠体重增加值明显低于对照组（P＜ 0.05）；10和200mg/kg/d剂量组幼鼠心脏脏器系数、3个高剂量组幼鼠肺脏脏器系数显著升高（P＜ 0.05）；10mg/kg/d剂量组幼鼠血清Glu水平明显降低（P＜ 0.05），50mg/kg/d剂量组幼鼠血清UREA水平明显升高（P＜ 0.05）。（2）实验二组：高剂量对照组幼鼠肺脏脏器系数较溶剂对照组明显升高（P＜ 0.05）；高剂量对照组和高剂量干预组血清Glu水平较溶剂对照组明显降低（P＜ 0.05）。 3.病理变化：（1）实验一组：各DEHP剂量组Nissl体数量较对照组显著减少，明显淡染，细胞排列疏松。（2）实验二组：各剂量组DG区Nissl体数量较对照组减少，明显淡染。 4.氧化应激：（1）实验一组：200mg/kg/d剂量组雄性幼鼠大脑皮层SOD活力较对照组明显降低（P ＜ 0.05）；（2）实验二组：高剂量对照组雄性幼鼠大脑皮层SOD活力较溶剂对照组明显降低（P ＜ 0.05）。 5.机制探索：（1）实验一组：Western blot结果显示，与对照组相比，10、50和200mg/kg/d剂量组ERK1/2、200mg/kg/d剂量组GABAARα2、50和200mg/kg/d剂量组GAD65+67表达水平、200mg/kg/d剂量组CREB表达水平降低，1mg/kg/d剂量组CREB磷酸化水平显著升高（P＜ 0.05）。（2）实验二组：Western blot结果显示，各剂量组海马GABAARα2、高剂量对照组GAD65+67表达水平显著下降（P＜ 0.05）；Muscimol可逆转DEHP暴露所导致的GAD65+67表达水平的降低。免疫组化结果显示，低剂量对照组、高剂量对照组和高剂量干预组CA2区、高剂量对照组CA3区GABAARα2表达水平明显下降（P＜0.05）；高剂量干预组CA3区GABAARα2表达水平较高剂量对照组明显升高（P＜ 0.05）；高剂量干预组CA3区ERK1/2表达水平较溶剂对照组显著减少（P＜0.05）；高剂量干预组CA3区ERK1/2表达水平显著低于高剂量对照组（P＜0.05）；高剂量干预组CA1区CREB表达水平明显降低（P＜ 0.05），低剂量干预组CA1、CA2和CA3区CREB表达水平均显著降低（P＜ 0.05）；低剂量干预组CA1和CA2区CREB表达水平明显低于低剂量对照组（P＜ 0.05）；高剂量干预组CA1、CA2和CA3区CREB表达水平明显低于高剂量对照组（P＜ 0.05）。结论：本实验条件下，DEHP暴露会引起雄性幼鼠出现焦虑和抑郁样行为，其作用机制可能与氧化应激反应、GABA信号通路和ERK1/2-CREB信号通路有关，具体机制尚有待于进一步深入研究。收起

关键词 : DEHP青春前期暴露 GABA信号通路 ERK1/2-CREB信号通路焦虑行为抑郁行为

8. 小型猪复合麻醉剂（XFM）及其颉颃剂对大鼠不同脑区ERK1/2信号通路的影响

[学位论文] 宋旭东东北农业大学 2014年硕士导师: 王洪斌共42页

摘要 : 本研究旨在探究XFM及其颉颃剂对大鼠中枢神经系统大脑皮层、小脑、脑干、丘脑、海马五个脑区ERK1/2、p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达的影响，藉以探讨小型猪复合麻醉剂(XFM)及其颉颃剂的麻醉及催醒机理，分析两者的作用在细胞内蛋白表达水平的调控机制及XF... 展开本研究旨在探究XFM及其颉颃剂对大鼠中枢神经系统大脑皮层、小脑、脑干、丘脑、海马五个脑区ERK1/2、p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达的影响，藉以探讨小型猪复合麻醉剂(XFM)及其颉颃剂的麻醉及催醒机理，分析两者的作用在细胞内蛋白表达水平的调控机制及XFM和XFM颉颃剂在中枢神经系统的交互作用部位，为更好地指导药物临床应用和研制新型安全高效的麻醉复方制剂奠定理论基础。将78只健康Wistar大鼠，随机分为3组，每组雌雄各半，分别为:麻醉组（M组）、颉颃剂组（J组）和颉颃剂催醒组（F组）。M组分为5个亚组即:空白对照组(MC组，n=6)、翻正反射消失组(M1组，n=6)、翻正反射消失1h组(M2组，n=6)、翻正反射恢复组(M3组，n=6)、翻正反射恢复1h组(M4组，n=6);J组分为三组即:空白对照组（JC组，n=6）、注射XFM颉颃剂5min组(J1组，n=6)、注射XFM颉颃剂1h组(J2组，n=6）;F组分为5个亚组，分别为:空白对照组(FC组，n=6)、早期催醒5min组(F1组，n=6)、早期催醒1h组(F2组，n=6)、晚期催醒5min组(F3组，n=6)、晚期催醒1h组(F4组，n=6)。试验结果表明: XFM麻醉过程中小脑、丘脑和海马中p-ERK1蛋白表达量随着麻醉加深而增加，与对照组相比有显著性差异（p＜0.05），苏醒过程中小脑及海马组织中p-ERK1蛋白的表达量逐渐下降，苏醒后1h基本恢复至对照组水平(p＞0.05);在小脑、丘脑中随麻醉时间的延长p-ERK2蛋白的表达逐渐上升，其中小脑的M1组、M2组，丘脑的M3组上升显著（p＜0.05、p＜0.01、p＜0.01），在脑干中p-ERK2的表达量呈现明显的下降趋势(p＜0.05)，至苏醒后1h与对照组相比下降极显著(p＜0.01)。 XFM颉颃剂对正常大鼠p-ERK1/2蛋白的表达与对照组相比无显著影响(p＞0.05); XFM颉颃剂使麻醉大鼠丘脑中p-ERK1蛋白的表达量下降，与对照组相比有显著差异(p＜0.05); XFM颉颃剂使麻醉大鼠小脑中p-ERK2蛋白表达量显著下降(p＜0.05)，使丘脑中p-ERK2蛋白表达上升，与对照组相比差异极显著(p＜0.01)。 XFM及其颉颃剂对大鼠各脑区ERK1/2蛋白和p-CREB蛋白表达量无显著影响。综上表明:以上相关脑区可能是XFM麻醉剂及其颉颃剂在中枢神经系统主要的作用部位，XFM颉颃剂可以在部分脑区对抗XFM对大鼠的麻醉作用，说明XFM颉颃剂可以在部分脑区通过影响ERK1/2信号通路而产生催醒作用;XFM及其颉颃剂的麻醉和催醒作用是由于ERK蛋白磷酸化水平的改变而引起，而与ERK1/2蛋白的重新合成无关。收起

关键词 : 小型猪复合麻醉剂 ERK1/2信号通路 p-CREB蛋白 p-ERK1蛋白磷酸化颉颃剂

9. 咪达唑仑对大鼠学习记忆相关海马PKA-ERK-CREB信号通路的影响

[学位论文] 周彤东北农业大学 2016年硕士导师: 肖建华共53页

摘要 : 目的意义:学习记忆的能力，是人类在工作、生活等活动中最基本的能力之一，更是保证动物在大自然中生存、栖息最重要的能力，PKA/ERK/CREB信号转导通路和Arc的表达，在学习记忆的形成中具有重要的作用。咪达唑仑能都导致学习记忆能力障碍，但是相关机... 展开目的意义:学习记忆的能力，是人类在工作、生活等活动中最基本的能力之一，更是保证动物在大自然中生存、栖息最重要的能力，PKA/ERK/CREB信号转导通路和Arc的表达，在学习记忆的形成中具有重要的作用。咪达唑仑能都导致学习记忆能力障碍，但是相关机制还不明确。因此，我们通过研究咪达唑仑对大鼠在水迷宫实验中学习记忆能力和海马PKA/ERK/CPREB信号转导通路、Arc的表达的影响，以学习记忆的机制和咪达唑仑的药理学特点为理论根据，进一步探讨咪达唑仑对大鼠学习记忆能力的影响及其可能机制，为咪达唑仑导致的认知功能障碍的机制提供一定的实验室研究证据。方法:72只雄性wistar大鼠，首先随机选取24只大鼠分成4组进行水迷宫试验:咪达唑仑高剂量组（mH组，150mg/kg）、咪达唑仑中剂量组（mM组，60mg/kg）、咪达唑仑低剂量组（mL组，20mg/kg）和生理盐水组(mNS)，给药后清醒即刻进行水迷宫定位航行试验，每天同一时间给药，待给药后大鼠能自发运动后进行训练，连续5天，在第六天的同一时间，再次给药，清醒即刻进行大鼠的空间探索试验。将剩余48只大鼠随机分为4组，每组12只:咪达唑仑高剂量组（MH组，150mg/kg）、咪达唑仑中剂量组（MM组，60mg/kg）、咪达唑仑低剂量组(ML组，20mg/kg)和生理盐水组(MNS)。每个剂量组在分为4个亚组，给药组大鼠分别在给药后发生轻度镇静或翻正反射消失时(T1)，重度镇静或翻正反射消失后10min或25min(T2)，觉醒(T3)和给药24h后(T4)断头处死大鼠，生理盐水组大鼠分别在腹腔注射生理盐水后5min（T1时间）、30min（T2时间）、1h（T3时间）和24h(T4时间)断头处死，分离海马组织，用RT-PCR方法检测PKA、ERK1、ERK2、CREB和Arc mRNA表达，用Western Blot方法检测p-ERK1/2和p-CREB蛋白表达。结果:(1)在水迷宫检测大鼠学习记忆能力的试验中，与生理盐水组比较，咪达唑仑组大鼠在定位航行试验中平均逃避潜伏期延长，在空间探索试验中穿越平台次数和第三象限停留时间比率均降低，并且咪达唑仑剂量越大，大鼠的平均逃避潜伏期越长，穿越平台次数和第三象限停留时间比率均越低。(2)用RT-PCR和Western Blot方法检测大鼠海马中PKA、ERK1、ERK2、CREB、Arc mRNA表达和p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达结果显示，咪达唑仑剂量依赖式的抑制了PKA、ERK1、ERK2、CREB、Arc mRNA的表达和p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达，但是这种抑制作用在给药24h之后消失了，大鼠海马中PKA、ERK1、ERK2、CREB、Arc mRNA表达和p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达恢复到了对照组水平。结论:根据以上试验结果我们得出，镇静剂量和麻醉剂量的咪达唑仑均可影响大鼠的空间学习记忆能力，并且咪达唑仑剂量越高，对大鼠学习记忆能力的影响程度越大。咪达唑仑剂量依赖式的抑制了海马中PKA-ERK-CREB信号通路和Arc基因的表达。由此我们推测，大鼠海马中PKA-ERK-CREB信号通路和Arc基因表达受到抑制，可能是咪达唑仑导致大鼠学习记忆能力下降的机制之一。收起

关键词 : 曾医学咪达唑仑麻醉药物学习记忆 PKA/ERK/CREB信号通路

10. 孕酮对AD细胞模型及动物模型神经再生的影响及机制研究

[学位论文] 孙爽河北医科大学 2018年博士导师: 侯艳宁共126页

摘要 : 中枢神经系统的发育和再生一直是神经科学界备受关注的研究领域,传统观念认为成年哺乳类动物脑组织的神经元是终级细胞,一旦遭受破坏将不能再生.然而,近年来发现哺乳类动物脑内海马齿状回(dentate gyrus，DG)和侧脑室室管膜下区(subventricular zone,... 展开中枢神经系统的发育和再生一直是神经科学界备受关注的研究领域,传统观念认为成年哺乳类动物脑组织的神经元是终级细胞,一旦遭受破坏将不能再生.然而,近年来发现哺乳类动物脑内海马齿状回(dentate gyrus，DG)和侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)的神经干细胞(neural stem cells,NSCs)能够分化为神经细胞—神经发生(neurogenesis).因此,新生神经元被认为能取代自然老化或者病变的神经元,最大限度地维护脑的功能和结构. 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种以进行性认知功能障碍为主要特征的中枢神经系统退行性疾病.AD的主要病理特征为:细胞外老年斑过度沉积,细胞内形成神经纤维缠结及神经元变性、缺失等.新生神经元是否能替代病变的神经元—神经再生(neuroregeneration),改善认知功能障碍已成为目前AD研究的一个新焦点.神经再生过程主要包括神经干细胞增殖,分化和成熟等.在AD脑和APP/PS1转基因小鼠中,海马神经元前体细胞向神经元分化比例明显减少,新生神经元的存活率与Aβ 产生和沉积的严重程度呈负相关,同时新生神经元的突起生长异常,提示神经再生障碍是导致AD认知功能进行性减退的重要病理机制之一.细胞周期阻滞及增殖相关信号通路的改变是细胞增殖抑制的两个主要机制.Aβ聚集使其具有神经细胞毒性,破坏细胞膜完整性引起细胞内DNA断裂,导致细胞周期异常.在AD患者海马组织cAMP水平下降,环磷酸腺苷反应序列结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)磷酸化水平下降,证实了CREB与AD的形成有密切关系. 神经甾体是中枢神经系统中各种甾体及其代谢产物的总称.孕酮(progesterone,PROG)是一种重要的内源性神经甾体,除了在生殖和内分泌系统发挥作用,还可影响神经系统功能包括促进神经细胞存活,抑制细胞凋亡,抑制炎症反应等.研究发现孕酮可促进PI3K/AKt信号通路激活,调节脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor,BDNF)的合成与释放.但是关于孕酮发挥神经保护作用的机制尚未全完阐明.一方面,孕酮可与其经典核受体结合,通过经典基因途径发挥调节作用;另一方面,可与细胞膜上GABAA受体、NMDA受体、PGRMC1/2受体等结合,通过非基因途径发挥快速调节作用.越来越多的证据表明孕酮可通过非经典受体机制发挥作用,其中研究最多的是孕酮膜结合蛋白1(progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1),其可能是孕酮发挥神经保护作用的重要靶点之一. 本实验采用Aβ活性片断Aβ25-35作用于原代培养的大鼠海马神经干细胞建立AD细胞模型,以APPswe/PS1dE9双转基因小鼠作为AD动物模型,分别研究了孕酮在细胞和动物水平对神经再生的影响及相关机制,为孕酮能用于AD的防治提供理论依据. 第一部分孕酮对AD细胞模型神经再生的影响目的:研究孕酮对AD细胞模型神经干细胞存活,增殖,凋亡及分化的影响. 方法:取新生 SD 大鼠海马组织进行体外分离培养及诱导分化，Immofluorescence方法检测神经干细胞标志物Nestin、诱导分化后成熟神经元标志物βⅢ-Tubulin及星形胶质细胞标志物GFAP的表达情况;采用Aβ25-35处理大鼠海马神经干细胞,建立AD细胞模型,应用CCK-8、Brdu掺入法(Brdu Elisa)、Western blot、Immofluorescence、流式细胞术等检测方法系统性的研究孕酮对 Aβ25-35诱导的神经干细胞存活、增殖、凋亡及分化的影响. 结果: 1.大鼠海马神经干细胞的分离培养、诱导分化及鉴定神经干细胞纯度>90%,可诱导分化为神经元及星形胶质细胞. 2.孕酮对AD细胞模型神经干细胞存活、增殖及凋亡的影响 CCK-8结果显示,与对照组相比,20μM Aβ25-35作用48后,大鼠海马神经干细胞明显损伤,细胞存活率为对照组的(59.3±6.4)%(P<0.01);与Aβ组比较,孕酮能浓度和时间依赖地促进Aβ诱导的NSCs存活.在0.01-10μM范围内,1μM孕酮对Aβ处理神经干细胞48h,促进存活率作用最显著,其存活率为对照组的(89.6±4.7)%(P<0.01). Immofluorescence结果显示,Brdu阳性标记位于增殖期细胞核内,定位准确.与对照组相比,Aβ损伤组Brdu阳性增殖细胞显著减少(P<0.01).与 Aβ 组相比,孕酮保护组 Brdu 阳性细胞显著增多(P<0.01).与 Brdu掺入法结果一致. Western blot结果显示,Aβ诱导的模型组胞浆中cleaved-caspase 3表达水平为对照组的2.6倍,显著高于对照组(P<0.01).与模型组相比,Aβ与PROG共孵育后cleaved-caspase 3表达水平无显著性差异(P>0.05). 3.孕酮对AD细胞模型神经干细胞分化的影响 Immofluorescence结果显示,与对照组相比,Aβ组DCX+阳性细胞数显著降低,分化成神经元前体细胞突起显著缩短(P<0.01).与Aβ组比较,PROG保护组DCX+阳性细胞数显著升高,细胞突起显著延长(P<0.01). 流式细胞术结果显示,与对照组相比,Aβ损伤组分化成βⅢ-Tubulin、GFAP阳性细胞的百分率显著降低(P<0.05).与Aβ组比较,PROG组分化成βⅢ-Tubulin阳性细胞的百分率显著升高(P<0.01),分化成GFAP阳性细胞的百分率无显著性差异(P>0.05). 小结: 1.孕酮能浓度和时间依赖地提高Aβ25-35诱导AD细胞模型神经干细胞的存活率,促进其增殖,对神经干细胞凋亡无影响. 2.孕酮促进Aβ25-35诱导的神经元前体细胞新生,促进其突起生长.同时逆转Aβ25-35抑制分化的作用,促进向神经元分化. 第二部分孕酮对AD细胞模型神经干细胞细胞周期的影响目的:研究孕酮对 AD 细胞模型神经干细胞细胞周期及其相关蛋白Cyclin D1、PCNA表达水平的影响. 方法:在大鼠海马培养神经干细胞Aβ损伤所致AD细胞模型的基础上,以神经甾体孕酮作为干预物,应用流式细胞术检测细胞周期的变化;应用Western blot技术,检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、PCNA表达. 结果: 1.孕酮对AD细胞模型NSCs细胞周期的影响与对照组相比,Aβ组G0/G1期细胞显著增多,S期细胞显著减少,增殖指数(PI)显著降低(P<0.05).与 Aβ 组相比,孕酮保护组 G0/G1期细胞显著降低,S期细胞显著增多,PI显著升高(P<0.05). 2.孕酮对AD细胞模型中NSCs细胞周期相关蛋白Cyclin D1、PCNA表达水平的影响 Western-blot检测显示,与对照组相比,Aβ组Cyclin D1、PCNA蛋白表达水平显著降低(P<0.05).与Aβ组相比,孕酮保护组Cyclin D1、PCNA蛋白表达水平显著升高(P<0.05). 小结:孕酮能够逆转Aβ所致G0/G1期细胞阻滞,上调细胞周期相关蛋白Cyclin D1、PCNA的表达水平,促进神经干细胞增殖. 第三部分孕酮对AD细胞模型神经干细胞AKt/CREB/BDNF信号通路的影响目的:研究神经甾体孕酮对CREB信号通路及其上游PI3K/AKt,下游BDNF三者之间调控作用. 方法:应用Western-blot、Brdu掺入法、流式细胞术分别检测孕酮和Rolipram(p-CREB激活剂)对Aβ诱导的神经干细胞CREB、BDNF的表达,增殖和分化的影响;应用上述方法检测孕酮和LY294002(PI3K/AKt通路抑制剂)对Aβ诱导的神经干细胞AKt、CREB及BDNF的表达,增殖和分化的影响. 结果: 1.孕酮对AD细胞模型中神经干细胞CREB/BDNF的影响 Western-blot结果显示:与Aβ损伤组相比,PROG保护组和Rolipram处理组均能引起p-CREB(Ser133)、BDNF蛋白表达显著升高(P<0.05),各组T-CREB表达水平组间无显著性差异(P>0.05). Brdu掺入法及流式细胞术结果显示:与模型组比,PROG保护组和Rolipram预处理组显著促进神经干细胞的增殖及向神经元分化(P<0.05). 2.孕酮AD细胞模型中神经干细胞PI3K/AKt的影响 Western blot结果显示:与Aβ损伤组相比,孕酮保护组能够引起p-AKt (Ser473)蛋白表达显著升高(P<0.05);与PROG保护组相比,LY294002组p-AKt蛋白表达显著降低(P<0.05),各组T-AKt、T-CREB表达水平组间无显著性差异(P>0.05).此外,各处理组神经干细胞p-CREB、BDNF变化水平与p-AKt一致. Brdu掺入法及流式细胞术结果显示:与模型组比,孕酮组显著促进神经干细胞增殖及向神经元分化(P<0.05).与PROG保护组相比,LY294002预处理组显著抑制NSCs的增殖及向神经元分化(P<0.05). 小结:孕酮促进PI3K/AKt - CREB信号通路的激活,上调BDNF的表达,发挥促进AD细胞模型神经干细胞增殖与神经元样分化作用. 第四部分孕酮促进AD细胞模型神经再生PGRMC1作用的研究目的:研究孕酮是否通过PGRMC1介导AKt/CREB/BDNF信号通路发挥保护作用. 方法:应用Immofluorescence检测PGRMC1和classic PR在神经干细胞的表达情况;Western blot检测Aβ对神经干细胞PGRMC1表达的影响;构建 PGRMC1 慢病毒载体,慢病毒感染 NSCs 筛选最佳转染复数(MOI)及时间;PCR、Western Blot、Brdu Elisa检测慢病毒感染神经干细胞后PGRMC1基因和蛋白的表达情况及慢病毒对神经干细胞增殖的影响;Western Blot、Brdu Elisa、流式细胞术检测PGRMC1siRNA对神经干细胞增殖和分化及AKt、CREB、BDNF表达的影响结果: 1.PGRMC1在神经干细胞的胞体和细胞核均有表达,classic PR在神经干细胞中无表达. 2.Aβ对神经干细胞中PGRMC1表达的影响 Western blot结果显示,Aβ处理48h后,PGRMC1表达显著升高.与Ctr组相比,Aβ组PGRMC1的相对表达量增加了67%(P<0.05). 3.慢病毒转染NSCs筛选最佳感染复数(MOI)及时间各组神经干细胞加入慢病毒培养液,于荧光显微镜下观察,慢病毒感染48h,GFP绿色荧光强度随着MOI值增加而增加,ENi.s+Poly组相比于其它组GFP绿色荧光强度显著增强(P<0.05).当MOI值为20时，GFP绿色荧光分布均匀,大量表达.以MOI值20感染神经干细胞,随着时间的延长,GFP绿色荧光从微弱逐渐增强,48h后,与对照组相比，GFP绿色荧光强度显著增强(P<0.05),因此慢病毒感染神经干细胞最佳培养液为ENi.s+Poly,MOI值为20,时间为48h,用于后续实验. 4.慢病毒感染神经干细胞后 PGRMC1 基因及蛋白表达水平及增殖的变化 NSCs正常组和Scrambled siRNA(随机序列作为收起

关键词 : 阿尔兹海默症孕酮神经干细胞细胞周期 AKt/CREB/BDNF信号通路