中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 张晓倩华中科技大学 2022年博士导师: 曹学兵共128页

摘要 : 目的：通过结构磁共振研究长期左旋多巴治疗的偏侧帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）大鼠全脑结构的改变。其次，聚焦于体积明显增加的损毁侧纹状体，研究LID大鼠脑结构变化的原因。最后，研究纹状体内注射选择性星形胶质细胞能量代谢抑制剂Fluoroc... 展开目的：通过结构磁共振研究长期左旋多巴治疗的偏侧帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）大鼠全脑结构的改变。其次，聚焦于体积明显增加的损毁侧纹状体，研究LID大鼠脑结构变化的原因。最后，研究纹状体内注射选择性星形胶质细胞能量代谢抑制剂Fluorocitrate（FC）对长期左旋多巴治疗的偏侧PD大鼠不自主运动的影响及分子机制。方法：将6-羟基多巴胺（6-OHDA）完全损毁的PD大鼠随机分为PD组（N=15）和LID组（N=15），Sham组作为对照（N=15）。LID组规律腹腔注射左旋多巴（12mg/Kg）和苄丝肼（6mg/Kg）（以下简称“L-DOPA”），PD和Sham组注射等量生理盐水，共一月。期间进行不自主运动（Abnormalinvoluntarymovements，AIMs）评分。在干预两周和一月时分别采集磁共振信号进行基于体素的形态测量学（Voxel-basedmorphometry，VBM）和弥散张量成像（Diffusiontensorimaging,DTI）分析。之后取材脑组织。通过免疫组化检测纹状体酪氨酸羟化酶（Tyrosinehydroxylase，TH）、神经元特异性核蛋白（Neuron-specificnuclearprotein，Neun）、胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）、离子钙结合适配器分子1（Ionizedcalciumbindingadaptermolecule1，Iba-1）、血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、突触素（Synaptophysin，SYP）、突触后密度蛋白95（postsynapticdensityprotein95，PSD95）的水平；通过免疫荧光检测内皮屏障抗原（EndothelialBarrierAntigen，EBA）的表达；通过Westernblot检测损毁侧纹状体TH、Neun、GFAP、VEGF、SYP、PSD95、突触相关蛋白97（synapse-associatedprotein97，SAP97）的水平；通过RT-PCR检测损毁侧纹状体GFAP、Iba-1、补体C3（ComplementC3，C3）、S100钙结合蛋白A10（S100calciumbindingproteinA10，S100A10）、炎症介质（白介素-1β，Interleukin-1β，IL-1β；白介素-6，Interleukin-6，IL-6；肿瘤坏死因子-α，Tumornecrosisfactor-α，TNF-α；环氧化酶2，Cyclooxidase2，COX2；诱导型一氧化氮合酶，Induciblenitricoxidesynthase，iNOS）的转录水平；通过高尔基染色检测损毁侧纹状体树突棘的变化。最后，对星形胶质细胞干预，选择合格PD大鼠随机分为L-DOPA+Vehicle（N=6）、L-DOPA+1nmolFC（N=6）、L-DOPA+2nmolFC组（N=6）。每天通过置管给予FC，1h后给予L-DOPA诱发AIMs，连续14天。通过RT-PCR检测损毁侧纹状体GFAP、Iba-1、C3、S100A10、IL-1β、TNF-α、IL-6、COX2、iNOS、FosB、ΔFosB、VEGF、SYP、PSD95的转录水平；通过尼氏染色检测纹状体尼氏小体含量；通过免疫组化检测Neun、GFAP、Iba-1、SYP、PSD95、VEGF、谷氨酸转运体1（Glutamatetransporter1，GLT-1）的表达；通过免疫荧光检测EBA、ΔFosB的表达；通过Westernblot检测损毁侧纹状体Neun、GFAP、Iba-1、C3、S100A10、SYP、PSD95、VEGF、GLT-1、细胞外信号调节激酶1/2（Extracellularsignal-regulatedkinases1/2，p-ERK1/2）、氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinasec-Jun，p-JNK）、FosB/ΔFosB的水平。结果：长期L-DOPA治疗改善（p＜0.001）6-OHDA损伤的PD大鼠运动缺陷（p＜0.01）的同时诱发了稳定且严重的LID。全脑灰质VBM发现：与Sham组相比，PD组大鼠双侧多处皮层和皮层下灰质体积进行性减少（p＜0.001），损毁侧为著。与PD组相比，LID组大鼠损毁侧背外侧纹状体、黑质和梨状皮层等处灰质体积进行性增加（p＜0.001）。与Sham组相比，LID组大鼠损毁侧背外侧纹状体、黑质处灰质体积增加在两个时间点仍很明显（p＜0.001）。DTI示：组间各脑区FA、MD、AD、RD等参数在两个时间点均无显著差异。纹状体细胞水平上发现：与Sham组相比，PD和LID组大鼠损毁侧纹状体TH表达下降（p＜0.0001）。三组间Neun表达无明显差异。与Sham组相比，PD组大鼠损毁侧纹状体GFAP，C3和Iba-1表达增加（p＜0.05），IL6、COX2转录水平上调（p＜0.05）；PSD95水平（p＜0.05）、中型多棘神经元（Mediumspinyneurons，MSNs）树突棘密度（p＜0.0001）、EBA表达（p＜0.05）降低。长期L-DOPA治疗进一步增加了GFAP和C3的水平（p＜0.01）而非Iba-1，上调了IL-1β、IL6、COX2的转录水平（p＜0.01），增加了SYP（p＜0.05）、PSD95（p＜0.01）、SAP97（p＜0.05）及树突棘（p＜0.0001）的水平，但未进一步降低EBA。6-OHDA损伤和L-DOPA治疗均未影响VEGF。药物干预实验示：1nmol和2nmolFC均增加了AIMs评分及损毁侧纹状体GFAP（p＜0.01）、C3（p＜0.01）、Iba-1（p＜0.01）、炎症介质（IL-1β、IL-6、COX2；p＜0.05）、FosB/ΔfosB（p＜0.05）的转录水平，却未影响SYP、PSD95、VEGF。1nmolFC对神经元无明显毒性。与Vehicle组相比，1nmolFC组的GFAP（p＜0.01）和Iba-1（p＜0.05）水平更高；C3转录水平上调（p＜0.01）；GLT-1及EBA表达降低（p＜0.05）；p-ERK1/2（p＜0.01）、p-JNK（p＜0.05）、FosB-ΔFosB（p＜0.01）的水平增加。结论：长期L-DOPA治疗部分逆转了PD大鼠多个皮层及皮层下脑区灰质体积的进行性减少，并主要诱导损毁侧背外侧纹状体、黑质和梨状皮层等处灰质体积的增加。6-OHDA损伤和长期L-DOPA治疗均未导致明显脑白质损伤。星形胶质细胞增生、炎症反应、异常的突触可塑性可能与长期L-DOPA诱导的LID大鼠纹状体灰质体积增加有关。纹状体内注射FC显著加重了LID，其机制可能与胶质细胞（A1型星形胶质细胞和小胶质细胞）增生，炎症反应，血脑屏障通透性增加，GLT-1表达降低，p-ERK1/2/p-JNK-FosB/ΔFosB通路激活等有关。收起

关键词 : 帕金森病脑影像学变化组织学

2. 未用药的早期帕金森病患者临床特征与脑网络的关联性研究

[学位论文] 曾玮琪华中科技大学 2022年博士导师: 曹学兵共119页

摘要 : 目的：早期帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）的症状多样且隐蔽，该期PD患者脑网络的变化仍不清楚。本研究旨在探讨未用药的早期PD患者临床特征以及静息态功能磁共振的变化及其与临床特征的关联性。方法：分别从武汉协和医院神经内科门诊和体... 展开目的：早期帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）的症状多样且隐蔽，该期PD患者脑网络的变化仍不清楚。本研究旨在探讨未用药的早期PD患者临床特征以及静息态功能磁共振的变化及其与临床特征的关联性。方法：分别从武汉协和医院神经内科门诊和体检中心招募未用药的早期PD患者和年龄匹配的健康人群作为对照。记录PD组和对照组的一般人口资料后，通过统一帕金森病评定量表（UnifiedParkinson’sDiseaseRatingScale，UPDRS）Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ评估PD患者运动和非运动症状；12项气味识别能力测试评估嗅觉；简易精神状态检查（Mini-MentalStateExam，MMSE）、蒙特利尔认知评估（MontrealCognitiveAssessment，MoCA）、汉密尔顿焦虑量表（HamiltonAnxietyScale，HAMA）、汉密尔顿抑郁量表（HamiltonDepressionScale，HAMD）评估受试者的认知和抑郁焦虑情况，使用k-均值聚类算法对PD亚型进行分类。对PD组受试者进行急性左旋多巴负荷试验（AcuteLevodopaChallengeTest，ALCT）。在用药前、用药后30、60、90和120分钟分别评估受试者UPDRSⅢ得分，按照量表评分项目针对的症状，分别计算震颤评分、强直评分、迟缓评分和轴性评分，并计算受试者在不同时间点评分变化情况和改善率。最后，对受试者进行静息状态功能磁共振成像。从完整水平、网络水平和边水平（edgelevel）分析大脑功能连接，将量表结果与脑连接成像的结果进行回归分析。结果：本组资料合计纳入80例未用药的早期PD患者和40名年龄匹配的健康对照。在PD组中男女比例为37:43，发病年龄59.96±10.40岁。从症状出现到就诊的时间为16.69±13.40个月。反映运动症状的UPDRSⅠ、Ⅱ、Ⅲ评分分别为2.01±1.90、6.18±3.68、26.13±12.09；反映认知功能的MMSE和MoCA评分分别为24.28±4.01和18.33±5.80；反映焦虑抑郁水平的HAMA和HAMD评分分别为11.26±7.64和12.48±9.18。据聚类分析，本组资料中未用药的早期PD患者分为三个亚型：早发震颤为主型（41.2%）、晚发痴呆强直为主型（27.5%）、晚发痴呆焦虑混合型（31.3%）。患者在ALCT后PD运动症状随时间逐步改善，90%以上患者在120分钟时改善率最高。多巴反应良好组（n=57）和多巴反应不良组（n=29）基线水平UPDRSⅢ评分为24.49±11.51vs.29.07±13.13；用药后30分钟平均改善率为10.50%vs.8.57%，用药后60分钟平均改善率为27.00%vs.13.13%，用药后90分钟平均改善率为37.24%vs.15.74%，用药后120分钟平均改善率为42.64%vs.17.27%；用药后120分钟，震颤评分平均改善率为44.93%vs.14.45%，强直评分平均改善率为40.57%vs.16.51%，迟缓评分平均改善率为50.15%vs.20.9%，轴性评分平均改善率为25.46%vs.12.89%。在完成脑连接扫描的47例PD患者中，与健康对照者相比，PD患者在完整水平上脑功能连接降低主要表现在视觉网络、躯体运动网络、边缘网络和深部灰质网络（p＜0.05，错误发现率（FalseDiscoveryRate[FDR]）校正）。网络内分析结果表明，深部灰质网络、躯体运动网络、边缘网络和腹侧注意网络的脑连接水平降低。网络间分析结果表明，共有九个脑连接对之间的静息状态网络功能连接性降低（allp＜0.05,FDR校正）。在边水平（edgelevel），边缘网络是异常功能连接的中心（p＜0.05，FDR校正）。回归分析结果表明，MoCA评分与深部灰质网络内功能连接强度（FunctionalConnectivity，FC）呈线性相关（p＜0.05），和深部灰质网络-腹侧注意网络的FC呈线性相关（p＜0.05）。HAMA评分与躯体运动网络、深部灰质网络和边缘网络FC呈线性相关（p＜0.05）；HAMD评分与躯体运动网络、深部灰质网络和腹侧注意网络FC呈线性相关（p＜0.05）。结论：本研究患者运动障碍症状严重，嗅觉损伤明显，认知水平较差，抑郁焦虑水平更高，可能与患者发病至就诊的时间较长有关。患者在ALCT后运动症状随时间逐步改善，绝大部分患者在120分钟时改善率最高。运动症状对ALCT反应各不相同，其中运动迟缓反应最好，轴性症状反应最差，临床医生应更多地关注轴性症状较为严重的患者后续对药物的反应性。患者对ALCT反应的差异可能与用药前运动迟缓严重程度有关；与年龄、情绪障碍、用药前UPDRSⅢ均无明显相关性；与认知功能的下降相关性无显著统计学差异。PD患者ALCT反应性的差异可能和PD的异质性有关。患者脑网络存在明显改变，主要累及躯体运动网络、深部灰质网络、边缘网络和视觉网络。上述异常脑连接可能与早期PD的运动症状和非运动症状有关。收起

关键词 : 帕金森病临床特征静息态功能连接

3. 基于VBM、HARDI技术对神经变性病、脑损伤的脑结构研究

[学位论文] 王吉华中科技大学 2021年博士导师: 曹学兵共119页

摘要 : 背景随着对大脑研究的逐渐深入，神经病学结合影像学的方法在研究动物和人类大脑疾病上的探索也逐步发展并趋于热点。磁共振分析技术对大脑灰质、白质结构的研究不仅提供了客观的活体无创性方法，而且提供了从不同角度来认识各类神经系统疾病的... 展开背景随着对大脑研究的逐渐深入，神经病学结合影像学的方法在研究动物和人类大脑疾病上的探索也逐步发展并趋于热点。磁共振分析技术对大脑灰质、白质结构的研究不仅提供了客观的活体无创性方法，而且提供了从不同角度来认识各类神经系统疾病的机会，以及通过这些技术获得的丰富的影像学数据再结合数学和统计学知识，让研究者进一步了解到大脑结构与疾病相关的信息。因此，充分利用和挖掘神经影像学所产生的信息，对于研究者认识神经系统疾病的病理变化，诊断分级，预测预后等有重要的帮助。本论文分别利用目前常用的小动物结构磁共振序列和人脑扩散张量成像扫描序列进行颅内病理改变下脑结构的研究：第一部分中文摘要目的：基于体素的形态学分析方法研究a-syn异常聚集大鼠颅内病理进展过程中的脑结构改变以及这些改变的脑结构与行为学的相关性方法： 1．健康成年雄性SD大鼠32只，随机分为3个月组和6个月组，并将二大组分别再次分为：PBS注入组和a-syn人全长纤维注入组。 2．行为学实验研究大鼠的运动能力和非运动能力的变化。 3．完成大鼠头部T2加权像的扫描，获得可用于分析的扫描图像。 4．对大鼠头部T2加权像进行灰白质分割等处理，然后进行比较分析，并将有差异的脑结构可视化映射。 5．将研究发现的差异脑结构提取体素体积与行为学进行相关性分析。 6．免疫组化技术检测大鼠内源性p-a-syn(Ser129)、DAT、TH的表达。 7．免疫荧光技术检测大鼠MAP2在黑质、皮层、海马CA1区域的表达。结果： 1．跨步实验、衣架实验、蔗糖实验的结果发现产生差异，阿扑吗啡试验无旋转以及Morris水迷宫实验结果无差异。 2．确定了大鼠脑部T2加权像的层距、扫描范围(是否覆盖大鼠小脑)等关键参数。 3．发现术后6个月组的实验组与对照组相比较，T2加权像上出现差异的灰、白质结构是：新皮质、部分初级感觉皮质、丘脑区域白质。术后3个月组无发现。 4．上述产生差异的脑结构体素体积提取值与6个月组的实验组大鼠行为学变化具有相关性。 5．免疫组化结果提示：内源性p-a-syn(Ser129)表达在实验组均增加；DAT在纹状体内表达在3个月组和6个月组的实验组均减少；TH在黑质部位表达在6个月组的实验组出现减少。 6．免疫荧光结果提示：在皮层区域，MAP2的表达在3、6个月组的实验组均减少；在黑质区域仅6个月组的实验组表达减少；在海马CA1区域表达均无减少。结论： 1．研究证实了VBM技术对在活体上研究a-syn异常聚集病理进展的可行性。 2．研究发现了术后6个月组产生差异脑结构为：新皮质、部分初级感觉皮质、丘脑区域白质，且这些差异脑结构的体素体积改变与实验组大鼠行为学变化具有相关性。 3．差异脑结构可能为这一病理进展的影像学上早期受累区域。第二部分中文摘要目的：基于HARDI技术对头部6种12个白质纤维结构进行重建、追踪、特征值提取，并利用机器学习方法进行并发症癫痫的预测研究方法： 1．收集574例儿童脑室出血或/和儿童脑室周围白质软化症及正常组的DTI数据及人口统计学相关信息。 2．运用HARDI技术对胼胝体、弓状束、丘脑皮质束、小脑中纤维束、小脑上纤维束、小脑下纤维束进行重建、追踪、特征值提取并观察脑室周围有无神经元迁移现象。 3．运用机器学习方法将上述白质纤维结构的特征值构建数学模型（逻辑回归、朴素贝叶斯、支持向量机、随机森林），研究上述模型预测并发症癫痫的区分度表现。 4．将逻辑回归等模型进一步进行校准曲线的研究，以此判断构建的模型的实际效能。 5．将数据集根据病情程度的不同分级进行模型的构建及校准曲线的分析。结果： 1．提取的上述6种纤维束随着疾病分级的加重，形态上有明显改变。 2．将上述白质纤维结构的特征值构建逻辑回归模型，模型的分区度在PVL、IVH合并PVL数据集中表现较好。 3．在PVL疾病中，胼胝体长度(减少)、右侧弓状束长度(减少)和体积(增加)、右侧丘脑皮质纤维体积(增加)、小脑中纤维体积(减少)和右侧小脑中纤维长度(增加)纳入逻辑回归预测模型可达到较好的区分度效果，准确率达85%。 4．在脑室出血合并PVL疾病中，将胼胝体长度(增加)和体积(减少)、右侧弓状束长度(减少)、左侧小脑中纤维束长度(增加)和FA值(减小)、左侧小脑下纤维束长度(减少)、右侧小脑上纤维束体积(减少)纳入逻辑回归预测模型可达到较好的区分度效果，准确率达89%。结论： 1．不同白质纤维结构的特征值可以预测并发症癫痫。 2．胼胝体、右侧弓状束、右侧丘脑皮质纤维、小脑中纤维和右侧小脑中纤维的上述改变在本论文PVL数据集中可预测癫痫的发生。 3．胼胝体、右侧弓状束、左侧小脑中纤维束、左侧小脑下纤维束、右侧小脑上纤维束的上述改变在本论文IVH合并PVL数据集中可预测癫痫的发生。收起

关键词 : 帕金森氏病神经变性病 a-突触核蛋白脑结构脑室出血脑室周围白质软化症高角分辨率扩散成像

4. TRH与p-ERK1/2、FosB-ΔFosB形成的正反馈环路参与左旋多巴诱发异动症发病机制的研究

[学位论文] 陈贵勤华中科技大学 2017年博士导师: 曹学兵共101页

摘要 : 本文分为以下几个部分: 第一部分:LID发生、发展与TRH、p-ERK1/2、FosB-ΔFosB等相关信号分子表达变化之间关系的研究目的:明确LID发生、发展过程中大鼠纹状体全转录本及主要标志信号分子表达水平变化。方法给予SD大鼠6-OHDA（2μg/... 展开本文分为以下几个部分: 第一部分:LID发生、发展与TRH、p-ERK1/2、FosB-ΔFosB等相关信号分子表达变化之间关系的研究目的:明确LID发生、发展过程中大鼠纹状体全转录本及主要标志信号分子表达水平变化。方法给予SD大鼠6-OHDA（2μg/μl,4μl）内侧前脑束立体定向注射，复制偏侧急性PD模型，在术后14天通过跨步试验、阿朴吗啡诱导旋转试验检测模型。对于成功PD模型，3天后给予左旋多巴（12mg/kg）和苄丝肼（6mg/kg）治疗，每天规律腹腔注射一次，共21天，复制偏侧LID大鼠模型。隔天一次对大鼠行为学进行AIMs评分；通过免疫组织化学方法检测大鼠黒质多巴胺能神经元毁损情况；通过基因芯片技术检测PD大鼠与LID大鼠纹状体区mRNA全转录水平表达差异；通过qRT-PCR检测纹状体区TRH与FosB转录水平的变化,通过免疫荧光双标法检测TRH与FosB-ΔFosB在纹状体的共表达情况，通过Western blot等技术检测纹状体区TRH、FosB-ΔFosB与p-ERK1/2表达水平。结果:与PD大鼠相比，LID大鼠毁损侧纹状体区TRH mRNA水平显著升高（P＜0.001）。毁损侧纹状体背外侧区TRH与FosB-ΔFosB共表达；在非毁损侧未见二者的表达。TRH mRNA在L-DOPA给药后处于持续高水平表达状态。LID大鼠毁损侧纹状体区TRH、FosB-ΔFosB与p-ERK1/2蛋白水平均高于PD大鼠。结论:LID的发生与发展伴随大鼠毁损侧纹状体TRH的持续高表达，并且异常表达的TRH可能与LID标志信号分子FosB-ΔFosB相关。第二部分:TRH对LID发生、发展及对p-ERK1/2等相关信号分子表达影响的研究目的:观察上调或下调TRH对LID大鼠行为学及纹状体区p-ERK1/2、ΔFosB等相关信号分子表达的影响，明确TRH是否可以直接调控p-ERK1/2的磷酸化水平。方法:在偏侧LID大鼠模型基础上，每天一次通过颅内置管技术向纹状体背外侧区立体定向注射TRH三肽或TRH类似物Taltirelin，同时30分钟后给予腹腔注射左旋多巴和苄丝肼，持续1周。包装慢病毒LV-TRH-shRNA-GFP,感染PC12细胞，筛选可以有效干扰TRH mRNA的序列。将TRH有效干扰序列包装成腺相关病毒AAV-TRH-shRNA-GFP,并立体定向注射至纹状体背外侧区，4周后开始给予每天一次腹腔注射左旋多巴和苄丝肼，持续1周，每天进行AIMs评分，第7天处死大鼠并检测纹状体区TRH、p-ERK1/2、FosB-ΔFosB的表达水平。培养PC12细胞，分别用溶剂（Vehicle）、MEK抑制剂（U0126）、TRH受体TRH-R1抗体（Anti-TR1）孵育细胞，2小时后分别给予细胞TRH三肽、TRH类似物Taltirelin干预，通过Western Blot技术检测p-ERK1/2的磷酸化水平在不同处理条件下的差异。结果TRH三肽、TRH类似物Taltirelin均可以显著加重异动症，增加p-ERK1/2、Δ 结果:FosB的表达；AAV-TRH-shRNA下调TRH表达可以显著减轻异动症，减少p-ERK1/2、ΔFosB的表达。TRH三肽、TRH类似物Taltirelin可以明显增加p-ERK1/2的磷酸化水平，并且这种升高效应可以被MEK抑制剂U0126及TRH-R1抗体所抑制。结论:TRH通过正向调控ERK1/2磷酸化与ΔFosB的表达而参与LID的发生与发展。第三部分:p-ERK1/2对FosB-ΔFosB与FosB-ΔFosB对TRH表达调控的研究目的:观察MEK抑制剂U0126对LID大鼠行为学以及FosB-ΔFosB、TRH等信号分子的调控。通过过表达FosB基因，明确FosB-ΔFosB对TRH的调控。方法:在偏侧PD大鼠模型基础上，给予每天一次腹腔注射左旋多巴和苄丝肼，持续21天。隔天一次进行AIMs评分。自左旋多巴给药第10天起，每天提前30分钟通过留置导管向纹状体立体定向注射MEK抑制剂U0126，第21天处死大鼠，通过qRT-PCR技术检测TRH mRNA、FosB mRNA表达水平，通过Western Blot技术检测p-ERK1/2、ΔFosB等信号分子的表达。包装过表达FosB基因慢病毒LV-FosB-GFP，感染PC12细胞，通过qRT-PCR技术检测TRH mRNA表达水平。结果:MEK抑制剂U0126可以显著降低AIM行为学评分，减轻异动症，减少FosB-ΔFosB、TRH的表达。过表达FosB可以显著增加TRH的表达。结论:p-ERK1/2可以正向调控FosB-ΔFosB与TRH。FosB-ΔFosB可以正向调控TRH。收起

关键词 : 左旋多巴诱发异动症正反馈环路促甲状腺激素释放激素 p-细胞外调节蛋白激酶 &Delta -低聚果糖B 低聚果糖B

5. TrkB受体激动剂对帕金森病动物模型的保护作用及机制研究

[学位论文] 聂淑科华中科技大学 2016年博士导师: 曹学兵共92页

摘要 : 第一部分TrkB受体激动剂 deoxygedunin对 MPTP诱导的PD小鼠模型的保护作用及机制研究目的：研究小分子酪氨酸受体激酶B（tyrosine receptor kinase B, TrkB）激动剂deoxygedunin对MPTP诱导PD小鼠模型的神经保护作用。方法：给予C57/BL6小... 展开第一部分TrkB受体激动剂 deoxygedunin对 MPTP诱导的PD小鼠模型的保护作用及机制研究目的：研究小分子酪氨酸受体激酶B（tyrosine receptor kinase B, TrkB）激动剂deoxygedunin对MPTP诱导PD小鼠模型的神经保护作用。方法：给予C57/BL6小鼠1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四羟吡啶（MPTP）腹腔注射（每次20mg/kg，2次/天，每次注射间隔2h）建立PD小鼠亚急性损伤模型。将36只8至9周大小的雄性C57/BL6小鼠随机分为三组：正常组、PD组、deoxygedunin干预组（自造模开始deoxygedunin干预2周，5mg/kg/d, i.p.）。采用爬杆实验评估MPTP小鼠的运动功能；酪氨酸羟化酶免疫组化评估deoxygedunin对MPTP小鼠黑质多巴胺能神经元和纹状体神经纤维完整性的保护作用；免疫荧光双标法检测 p-TrkB（Y816）与TH阳性神经元的共表达情况；RT-PCR检测中脑黑质BDNF、a-synuclein及TrkBmRNA表达水平；Western blot法检测MPTP小鼠中脑黑质TH、BDNF、p-TrkB/TrkB、p-MAPK/MAPK、p-Akt（S473）/Akt、caspase-3、Bcl-xl的表达变化。结果：MPTP给药后模型组C57/BL6小鼠体重随给药时间逐渐下降，deoxygedunin能够缓解MPTP引起的小鼠体重下降。在MPTP小鼠爬杆实验中，干预组小鼠头转向下时间(T-turn)及下至杆底时间(TLA)均较 PD组小鼠明显缩短（P＜0.05）。TH免疫组化发现经干预组小鼠黑质纹状体酪氨酸羟化酶表达水平较PD模型组显著升高（P＜0.05），同时中脑黑质磷酸化TrkB的水平较PD模型组和正常对照组显著升高（P＜0.05）。干预组和PD模型组小鼠黑质BDNF mRNA表达较正常组升高，PD组α–synuclein mRNA表达较正常组和干预组升高，差异均无统计学意义（P＞0.05）；deoxygedunin干预组TrkB mRNA表达水平较PD模型组和对照组显著升高（P＜0.001）。在 MPTP神经毒性小鼠 PD模型中，deoxygedunin干预组 TH、p-TrkB/TrkB、p-MAPK/MAPK、p-Akt（S473）/Akt、Bcl-xl蛋白表达均较PD模型组升高，caspase-3表达较对照组降低（P＜0.05）。结论：deoxygedunin能够改善MPTP神经毒性小鼠模型的运动减少，可能通过激活TrkB受体及下游信号通路如PI3k/Akt及MAPK等，抑制凋亡信号通路，发挥多巴胺神经元神经保护作用。第二部分 AEP特异性切割产物 tau蛋白 N368片段和 a-synuclein在三种 PD动物模型中的表达目的：天冬酰胺内切酶（asparagine endopeptidase, AEP)激活并特异性切割tauN368片段是AD病理改变中发现的新现象，黑质纹状体a-synuclein的磷酸化和异常聚集是帕金森病（Parkinson’s disease,PD）的主要病理改变，本研究拟在3种经典PD模型中检测AEP特异性切割的tauＮ368片段和a-synuclein蛋白在黑质、纹状体、海马等不同脑区是否存在共表达。方法：帕金森动物模型制备：（1）慢性MPTP PD小鼠模型：将20只8周龄C57BL/6雄性小鼠，随机分为对照组和模型组，给予模型组小鼠背部皮下注射MPTP(25mg/kg/次)，每周2次，连续5周；对照组经同样注射方式给予同等体积的生理盐水。（2）慢性小鼠鱼藤酮PD模型：将20只C57BL/6雄性小鼠，随机分为对照组和模型组，给予模型组小鼠背部皮下注射rotenone(１mg/kg/d)，连续注射50天；对照组按同样方式给予同等体积的DMSO和生理盐水混合液。（3）鱼藤酮大鼠PD模型：将24只雌性SD大鼠，随机分为对照组和模型组；给予模型组大鼠背部皮下注射rotenone(1.5mg/kg/day)，连续注射5周；对照组按同样方式给予同等体积的溶媒（DMSO和玉米油混合液）背部皮下注射。酪氨酸羟化酶免疫组化和荧光法评估不同PD模型黑质多巴胺能神经元的损伤情况；免疫荧光双标法检测三种PD模型海马、皮质、纹状体和黑质a-synuclein和tau N368共表达情况。采用免疫组织化学和Western blot方法检测各组动物中脑黑质、纹状体、海马磷酸化a-synuclein和tau N368表达水平。结果：三种PD动物模型中脑黑质致密部TH阳性神经元数目明显减少，提示PD模型造模成功。免疫荧光双标法检测发现鱼藤酮诱导的PD小鼠模型中脑黑质部位a-synuclein和tau N368存在共表达现象，且表达水平较对照组显著增加，而在海马和皮层中未发现显著的共表达现象：鱼藤酮 PD小鼠模型海马 CA1区 a-synuclein和tau N368表达与正常组相比未见明显变化，而皮层tau N368表达较对照组明显增多。MPTP诱导的小鼠PD模型黑质和海马CA1区tau N368表达增多，而在相同解剖部位的a-synuclein表达未见明显变化；皮层的a-synuclein和tau N368表达组间均未见显著变化。免疫组化提示鱼藤酮诱导的PD大鼠模型纹状体a-synuclein和tau N368表达均较对照组明显增多，中脑黑质磷酸化a-synuclein表达增多，同时黑质和海马tauN368表达组间未见显著性差异。在模型组Western blot检测同时发现三种PD动物模型纹状体磷酸化a-synuclein（Ser129）和tau N368表达水平均较对照组增加，而在黑质和海马中表达存在不一致性：MPTP诱导的PD小鼠模型黑质和海马tau N368表达较对照组升高，而p-a-synuclein(S129)表达无明显变化；鱼藤酮诱导PD小鼠模型海马p-a-synuclein(S129)和tau N368表达与对照组相比均未见明显变化；鱼藤酮诱导的PD大鼠模型海马p-a-synuclein(S129)表达较对照组增加，而tau N368的表达无明显变化。结论：PD动物模型的中脑黑质和纹状体存在AEP激活后特异性切割tau蛋白现象，所特异性切割的tau蛋白片段N368和a-synuclein在纹状体或黑质存在共表达，提示AEP及其特异性切割作用可能参与了帕金森的发病过程。第三部分7,8-DHF通过调节AEP表达及其切割效应对鱼藤酮诱导的PD大鼠模型的保护作用研究目的：研究酪氨酸受体激酶B（tyrosine receptor kinase B, TrkB）激动剂7，8-DHF对鱼藤酮诱导的PD大鼠模型的保护作用及作用机制。方法：将36只9月龄的SD大鼠随机分为三组：分布为照组（10只），模型组（13只），7，8-DHF干预组（13只）。给予PD模型组和干预组大鼠背部皮下注射鱼藤酮(2mg/kg/day)，连续注射5周；对照组按同样方式给予同等体积的溶媒（如DMSO和玉米油混合液）背部皮下注射；自造模开始给予干预组大鼠7，8-DHF干预5周，5mg/kg/day, i.p.）。采用旷场实验评估PD大鼠的行为学；酪氨酸羟化酶TH免疫组织化学及免疫荧光评估大鼠黑质多巴胺能神经元和纹状体神经纤维的完整性；免疫组化检测黑质p-TrkB（Y816）表达水平；Western blot法检测各组大鼠中脑黑质和纹状体 TH、BDNF、p-TrkB/TrkB、p-MAPK/MAPK、p-Akt（S473）/Akt、AEP、p-tau(S396)、p-a synuclein（S129）、a-synuclein和tauN368的表达变化。结果：鱼藤酮造模后，旷场实验组中模型组大鼠运动距离较正常组明显减少，给予7，8-DHF干预可改善鱼藤酮诱导的PD模型运动障碍。TH免疫荧光发现干预组大鼠黑质TH阳性细胞数较模型明显增多（P＜0.05），纹状体TH免疫组织化学提示7，8-DHF能够保护PD模型纹状体多巴胺能神经纤维的完整性。模型组大鼠黑质和纹状体的p-a-synuclein（Ser129）、p-tau(S396)、AEP表达及特异性切割产物tau N368表达均较正常组和干预组升高（P＜0.05）。与模型组相比较，干预组黑质p-TrkB/TrkB及 p-Akt/Akt水平显著升高，p-MAPK/MAPK水平下降，纹状体及黑质 AEP、p-a-synuclein（Ser129）、a-synuclein、p-tau(S396)及tau N368的表达减少（P＜0.05）。结论：7,8-DHF能够改善鱼藤酮诱导PD模型大鼠的运动障碍，可能通过激活TrkB受体及下游信号通路Akt，降低MAPK、a-synuclein和tau的异常磷酸化水平，抑制AEP表达及其特异性切割作用，发挥神经保护作用。收起

关键词 : 帕金森病神经保护 TrkB受体激动剂动物模型运动障碍

6. 依托拉嗪联合金刚烷胺对左旋多巴诱发异动症的作用及电生理机制探讨

[学位论文] 杨晓梅华中科技大学 2022年硕士导师: 曹学兵共68页

摘要 : 目的：探索依托拉嗪(Eltoprazine，ELTO)联合金刚烷胺(Amantadine，AMAN)对左旋多巴诱发异动症（levodopa-induceddyskinesias，LID）大鼠模型的抗异动症作用，并从电生理学角度研究其可能的机制。方法：脑立体定向注射6-羟基多巴胺(6-hydroxyd... 展开目的：探索依托拉嗪(Eltoprazine，ELTO)联合金刚烷胺(Amantadine，AMAN)对左旋多巴诱发异动症（levodopa-induceddyskinesias，LID）大鼠模型的抗异动症作用，并从电生理学角度研究其可能的机制。方法：脑立体定向注射6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)入大鼠右侧内侧前脑束（medialforebrainbundle，MFB），建立急性偏侧帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)大鼠模型（n=48）。14天后，通过皮下注射阿扑吗啡（apomorphine，APO）诱发旋转行为，验证偏侧完全损毁的PD模型是否成功建立。将成功建立偏侧完全损毁PD模型大鼠置入多通道微电极，置入位点选择大鼠右侧初级运动皮层（primarymotorcortex，M1）及背外侧纹状体（dorsolateralstriatum，DLS）。微电极置入一周后，连续7天大鼠腹腔注射左旋多巴（Levodopa,L-DOPA）加苄丝肼（benserazidehydrochloride）制备稳定的LID模型，共30只大鼠成功建立稳定LID模型。随后，将LID大鼠（n=30）随机分配到三个实验组：ELTO组（n=10）、AMAN组（n=10）以及AMAN+ELTO组（n=10），并分别腹腔注射ELTO（0.6mg/kg）+L-DOPA（12mg/kg）、AMAN（60mg/kg）+L-DOPA（12mg/kg）、以及AMAN（60mg/kg）+ELTO（0.6mg/kg）+L-DOPA（12mg/kg）治疗七天。由于L-DOPA（12mg/kg）+苄丝肼（6mg/kg）连续治疗7天是诱导偏侧损毁大鼠产生严重且稳定LID的一种有效剂量方案，其对行为学的改变与治疗14天无明显差异。因此本实验将左旋多巴治疗第七天设置为干预前的基线（记为：L-DOPA组），通过比较不同药物干预7天与干预前的差异来观察每组药物对LID的治疗效果。实验过程中选择L-DOPA注射第一天（D1）和第七天（D7），以及三组药物分别治疗的第七天（D14），对大鼠进行异常不自主运动（abnormalinvoluntarymovements，AIMs）评分，同时采集M1和DLS的电生理数据。电生理数据采集结束后将大鼠处死，随即灌流后取大鼠脑组织，并进行纹状体区域的TH染色和积分光密度（IOD）分析。最后进行行为学评分及电生理学的LFP和SPNs单神经元放电模式分析。结果：相较于第一天（D1），左旋多巴治疗第七天（D7）AIMs总评分（D1:26.9±3.8vs.D7:61.0±3.2，p＜0.0001）和LID期时长（D1:85.2±9.2minvs.D7:92.8±6.4min，p＜0.05）明显增加；与LID相关的hγ振荡波动明显更小（D1:76.1±3.6vs.D7:53.2±6.3，p＜0.01）；纹状体投射神经元（striatalprojectionneurons，SPNs）对多巴胺的不稳定放电比例增加（D1:33.66%vs.D7:50.39%，p＜0.05）。而连续七天使用ELTO、AMAN或AMAN+ELTO后，与L-DOPA使用第七天相比，ELTO组、AMAN组以及AMAN+ELTO组AIMs总评分分别下降了48.4%、33.7%、56.1%（p＜0.05）；同时，hγ振荡波动分别增加了17.9%、17.2%、38.2%（p＜0.05）；且SPNs对DA的不稳定反应比例分别减少了14.3%、16.6%、18.64%（p＜0.05）。结论：依托拉嗪联合金刚烷胺能有效发挥对左旋多巴诱发异动症大鼠的抗异动症作用，且效果比单独使用金刚烷胺或者依托拉嗪效果更好。这种抗异动症作用可能与减少SPNs对DA的不稳定放电比例相关。收起

关键词 : 帕金森病异动症电生理依托拉嗪金刚烷胺

7. 大鼠纹状体注射α-synuclein N103/tau N368预制原纤维对肠道功能的影响及机制研究

[学位论文] 王嘉玲华中科技大学 2022年硕士导师: 曹学兵共67页

摘要 : 目的：阐明注射α-synN103/tauN368预制原纤维（Preformedfibrils,PFFs；以下全文均简称为PFFs）诱导产生的内源性α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）聚集体在脑内扩散后能否传播到胃肠道并引起肠道的病理学和症状改变，以及明确这种长距离传播途径... 展开目的：阐明注射α-synN103/tauN368预制原纤维（Preformedfibrils,PFFs；以下全文均简称为PFFs）诱导产生的内源性α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）聚集体在脑内扩散后能否传播到胃肠道并引起肠道的病理学和症状改变，以及明确这种长距离传播途径是否主要经过迷走神经。方法：予雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠纹状体背外侧脑立体定位分别注射15μg和30μgPFFs构建病理模型，注射等体积PBS构建对照组，分别设立1，3，6个月3个时间点，每组各时间点8只。在各时间点均检测粪便含水量、胃肠转运率等胃肠道功能指标。免疫组化和免疫荧光方法，在1个月时检测脑内传播情况，近端结肠α-syn聚集情况及聚集物的特征等。免疫蛋白印迹方法检测结肠内的α-syn、AT8聚集程度，多巴胺能神经元丢失情况即酪氨酸羟化酶（Tyrosinehydroxylase,TH）表达水平，肠道胶质细胞胶质细胞原纤维酸性蛋白（Glialfibrillaryacidicprotein,GFAP），细胞因子白介素（Interleukin,IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor，TNF）-α表达水平；HE染色和免疫组化观察嗜酸性粒细胞和巨噬细胞浸润程度。此外，设立了膈下迷走神经切断术和（或）PFFs注射，使用免疫组化方法检测迷走神经是否参与脑内向肠道的传播。结果：在1个月时大鼠脑内可观察到明显的α-synpSer129阳性信号及双向的脑内扩散。近端结肠可见病理性α-syn随时间增加出现聚集且伴有多巴胺能神经元丢失（p＜0.05），黏膜和黏膜下层亦可见嗜酸性粒细胞和巨噬细胞浸润（p＜0.05）。低剂量组中病理性α-syn、多巴胺能神经元丢失等病理改变在6个月时出现减轻，与对照组相比无统计学差异（p＞0.05）。3个月时GFAP、IL-6表达水平明显增加（p＜0.01），且一直持续到6个月时。高剂量组GFAP表达水平无明显改变，但病理性α-syn在6个月时仍明显存在（p＜0.05），且同时出现了IL-1β水平的增加（p＜0.01）。另外，高剂量组在3个月时即出现粪便含水量下降，6个月时还伴随胃肠转运率下降（p＜0.05）。结论：(1)纹状体注射PFFs后诱导的内源性病理性α-syn可经迷走神经快速地传播到近端结肠；(2)不同剂量的PFFs均能引起结肠病理性α-syn聚集，肠道炎症，细胞因子表达水平改变等变化；(3)低剂量的PFFs最终诱发肠道神经系统自我恢复，降解病理性α-syn；而高剂量的PFFs可以导致结肠病理性α-syn聚集，肠道炎症，肠道功能障碍等。收起

关键词 : 帕金森病 &alpha -synuclein 突触核蛋白病理肠道神经系统

8. 左乙拉西坦防治左旋多巴诱发偏侧帕金森大鼠异动症的作用

[学位论文] 杜欢华中科技大学 2012年硕士导师: 曹学兵共52页

摘要 : 目的:研究左乙拉西坦(levetiracetam,LEV)对左旋多巴诱发偏侧帕金森大鼠异动症的防治作用并探讨其可能的机制。方法:6-羟多巴胺(6-OHDA)立体注射制备偏侧毁损帕金森病大鼠模型,将模型分对照组,15mg左乙拉西坦,30mg左乙拉西坦,60mg左乙拉西坦实验... 展开目的:研究左乙拉西坦(levetiracetam,LEV)对左旋多巴诱发偏侧帕金森大鼠异动症的防治作用并探讨其可能的机制。方法:6-羟多巴胺(6-OHDA)立体注射制备偏侧毁损帕金森病大鼠模型,将模型分对照组,15mg左乙拉西坦,30mg左乙拉西坦,60mg左乙拉西坦实验组,将各实验组药物在左旋多巴(左旋多巴25mg/kg+盐酸苄丝肼6.25mg/kg)腹腔注射前15min灌胃注入,一天两次(9am;5pm),对照组在左旋多巴治疗之前给予生理盐水。总的实验周期为2周,期间观察大鼠行为学变化,通过异常不自主运动(AbnormalInvoluntaryMovement,AIM)评分评价异动症的严重程度,实验终点时通过免疫印迹技术检测纹状体区?FosB、总DARPP-32、34位点的磷酸化DARPP-32(p-DARPP-32)、总ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达水平,免疫组化技术比较纹状体区FosB/?FosB蛋白表达变化。结果:与对照组比较,左乙拉西坦实验组大鼠异动症评分显著降低;其中,舞蹈样和肢体不自主样动作从实验第3天起在左乙拉西坦各剂量组即有明显改善(P<0.05),这种作用一直维持到治疗终点。轴性和头面部不自主运动只在大剂量组(60mgLEV)从实验第7天起有明显改善。与对照组比较,总的AIM评分在实验组从第5天起即有显著下降,随着实验时间的延长,只有30mg和60mg实验组对异动症评分有明显减少(P<0.05)。对侧旋转行为在不同组之间没有显著差异。纹状体损毁侧?FosB、p-DARPP-32、p-ERK1/2蛋白表达较健侧明显升高(P<0.01)。与对照组比较,各剂量实验组毁损侧?FosB蛋白表达明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05),毁损侧p-ERK1/2表达在30mg和60mg实验组有显著降低(P<0.05),毁损侧p-DARPP-32表达在60mg实验组有显著减少(P<0.01)。总DARPP-32,ERK1/2表达在各组之间没有显著差异。免疫组化结果显示纹状体毁损侧FosB/?FosB阳性细胞数表达实验组较对照组明显减少(P<0.05),实验组这些蛋白表达的减少均成剂量依赖性。结论:左乙拉西坦具有阻止左旋多巴诱发偏侧毁损帕金森大鼠异动症发生的作用,其治疗效果呈剂量依赖性,并可以逆转相关信号通路蛋白的异常表达,可能通过PKA相关通路发挥作用。收起

关键词 : 左乙拉西坦左旋多巴偏侧帕金森异动症防治作用

9. 高表达ΔFosB诱发帕金森病大鼠异动症的作用及其基因靶点的研究

[学位论文] 陈媛媛华中科技大学 2011年硕士导师: 曹学兵共52页

摘要 : 目的：探讨转录因子ΔFosB的高表达在帕金森病大鼠异动症中的作用及对NR1、GluR1和NF-κB mRNA表达水平的影响。方法：立体定位注射6-羟多巴胺至大鼠左侧前脑内侧束以制作偏侧帕金森病(Parkinson disease，PD)大鼠模型，腹腔注射1次复方左旋多巴... 展开目的：探讨转录因子ΔFosB的高表达在帕金森病大鼠异动症中的作用及对NR1、GluR1和NF-κB mRNA表达水平的影响。方法：立体定位注射6-羟多巴胺至大鼠左侧前脑内侧束以制作偏侧帕金森病(Parkinson disease，PD)大鼠模型，腹腔注射1次复方左旋多巴检测PD大鼠对左旋多巴的反应。随机把大鼠分为实验组和对照组，对实验组大鼠毁损侧纹状体内立体定位注射高表达ΔFosB基因的腺相关病毒（rAAV-ΔFosB-EGFP），制备高表达ΔFosB的PD大鼠模型，同时对照组大鼠毁损侧纹状体内注射rAAV-EGFP，各组大鼠右侧纹状体作为自身健侧组。各组大鼠按照再次接受左旋多巴治疗的时间又都分为4个亚组，分别饲养3周、6周、9周和12周后，腹腔注射再次给药，剂量同前，评测各亚组的行为学变化，应用免疫组织化学技术检测各亚组纹状体区ΔFosB表达水平的变化，应用实时定量PCR技术检测各亚组纹状体区NR1、GluR1和NF-κB mRNA表达水平的变化。结果：各组PD大鼠在未注射病毒之前，单次使用左旋多巴治疗均无异动症出现。实验组大鼠接受左旋多巴治疗后均表现有异动症且伴有毁损侧纹状体区ΔFosB的高表达。随着时间延长，实验组各亚组大鼠异动症评分逐渐增高(P＜0.01)，且伴有毁损侧纹状体区ΔFosB、NR1和NF-κB mRNA表达水平逐渐增高。在同一时间周次，实验组毁损侧纹状体区ΔFosB、NR1和NF-κB mRNA的表达水平均高于对照组，也高于自身健侧组，差异具有统计学意义(P＜0.05），对照组各亚组毁损侧纹状体区ΔFosB和NF-κB mRNA也高于自身健侧组，差异有统计学意义（P＜0.05），GluR1 mRNA在实验和对照各组表达水平未见有明显变化。结论：对PD大鼠毁损侧纹状体区注射高表达ΔFosB的腺相关病毒载体可较好的模拟异动症表现；转录因子ΔFosB可能通过调控NR1和NF-κB mRNA的改变参与了PD大鼠异动症的发生。收起

关键词 : 帕金森病异动症转录因子&Delta FosB NR1表达 GluR1表达转录因子-&kappa B mRNA表达

10. 高表达△FosB对帕金森病异动症大鼠纹状体区运动环路的调节作用

[学位论文] 李爱玲华中科技大学 2011年硕士导师: 曹学兵共51页

摘要 : 目的：探讨纹状体区ΔFosB 高表达水平与帕金森病异动症发生的关系，并研究其对强啡呔（Pdyn）、脑啡肽（PPE）、谷氨酸脱羧酶67（GAD67）的调节作用。方法：左侧内侧前脑束立体定位注射6-羟多巴胺（6-OHDA）制备偏侧帕金森病（PD）大鼠模型。毁... 展开

关键词 : 帕金森病异动症高表达△FosB 强啡肽脑啡肽谷氨酸脱羧酶67 运动环路