中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 田野西安电子科技大学 2022年硕士导师: 袁细国；管洪清共73页

摘要 : 拷贝数变异是人类基因组研究中一种常见的结构变异类型，它由于发生基因组重新排列导致了许多重大疾病，如:肺癌、白血病和心血管疾病等，对人类复杂疾病的研究具有重要的生物学意义。拷贝数变异检测是复杂疾病医学研究中拷贝数变异系统分析的重要步骤... 展开拷贝数变异是人类基因组研究中一种常见的结构变异类型，它由于发生基因组重新排列导致了许多重大疾病，如:肺癌、白血病和心血管疾病等，对人类复杂疾病的研究具有重要的生物学意义。拷贝数变异检测是复杂疾病医学研究中拷贝数变异系统分析的重要步骤，其检测结果的准确性直接决定了该类疾病临床诊断的可靠性和基因治疗策略的安全性。因此，拷贝数变异检测最关键的任务是提高检测结果的准确率和灵敏度。第二代测序平台的最新发展给在碱基水平分辨率检测拷贝数变异提供了前所未有的机会，然而由于第二代测序数据的内在特性，准确检测拷贝数变异仍然是一项具有挑战性的任务。目前，已经涌现出许多拷贝数变异检测算法，但它们大多从基因组数据的全局角度来建立模型，因此可能会忽视一些局部区域的拷贝数变异，并且在检测较高覆盖深度的测序数据时表现不佳。通过分析现有算法的不足并结合拷贝数变异的特征，本文提出了一种基于密度峰值算法的拷贝数变异检测方法dpCNV。dpCNV方法的检测流程如下:首先，利用一个数据分割算法对测序数据进行去噪，再从去噪后的数据中提取两个特征，即局部密度和最小距离，组成二维数据;然后，基于此二维数据建立二维零分布来评估每个数据点的变异显著性，并将显著的数据点判定为拷贝数变异区域。dpCNV方法的创新点有:(1)基于密度峰值算法从测序数据中提取出两个重要特征并组成二维数据，使得局部区域的拷贝数变异片段更容易被检测到。(2)基于此二维数据建立二维零分布来判断哪些区域发生拷贝数变异，使得判断结果更加客观、可靠。本文在两种仿真方法的数据集上分别测试了dpCNV方法的性能，并调整最优参数与几种现有方法进行比较。实验结果表明，dpCNV方法在灵敏度和F1-值方面优于其它方法，并且在覆盖深度高的数据中表现优异。为了进一步检验dpCNV方法的实用性，本文将其应用于三组来自EGA数据库的肿瘤测序样本，以重叠密度分数为指标与现有方法作比较。结果显示dpCNV方法在其中两组数据中位列第一，在另一组数据中排名第二，验证了dpCNV方法的有效性。我们期望dpCNV方法可以作为现有方法的补充，并有望成为基因组突变分析领域的常规工具。收起

关键词 : 拷贝数变异第二代测序数据密度峰值零分布第二代测序

2. 基于二代测序技术对SNP检测软件的比较研究

[学位论文] 何熠石河子大学 2019年硕士导师: 马磊共67页

摘要 : 目的：在高通量技术和SNP分子标记技术日渐普及的今天，越来越多的研究需要从高通量测序技术产生的reads中获得有效的SNP遗传信息，以进行进一步研究。随着分子实验技术的进一步发展，更多的有效、快速并且高通量的SNP检测方法不停的被研究者开发出来... 展开目的：在高通量技术和SNP分子标记技术日渐普及的今天，越来越多的研究需要从高通量测序技术产生的reads中获得有效的SNP遗传信息，以进行进一步研究。随着分子实验技术的进一步发展，更多的有效、快速并且高通量的SNP检测方法不停的被研究者开发出来。但目前对于各种SNPcalling的方法比较还比较少，究竟什么样的测序策略配合什么种类的SNPcalling方法能获得最有效的结果依然不明朗。在大多是研究工作者将该步骤交给测序公司处理分析的背景下，这一点尤为突出。方法：本研究通过比较目前较为常用的六种SNPcalling软件（Varscan，Altas-snp2，GATK，Freebayes，SOAPsnp2和SAMtools）在两种数据集，模拟数据集和真实数据集中callingSNP的表现，对这一问题进行了一定程度上的解读，为研究者对于目前的SNPcalling情况进行了解提供了便利。结果：研究结果显示，这六种SNPcalling软件产生的分析结果差异较大：在使用真实数据进行SNP检测的结果中，SOAPsnp能够检测出最多的SNP，Freebays和Atlas-snp2检测出的SNP数量较少；是否去除低质量碱基对这款软件具有一定影响，去除低质量碱基能够检测出更多的SNP；这六种软件calling出的SNP一致性较差，dbSNP与Non-dbSNP相比通常具有更高的一致性，这表明低覆盖测序数据中被鉴定的Non-dbSNP的质量较低。在使用模拟数据进行SNP检测的结果中，测序深度对SNP检测具有显著影响，而测序的reads长度则对SNP检测没有明显影响；如果仅从实验结果看，250bp的测序策略结果最好；在5×下，除了Varscan和Altas-snp2以外，都能得到较好的结果，其余4个软件的SNP检出率都在85%以上；如果测序深度达到7×，基本上除了Varscan，其余软件都能得到很好的结果，检出率都在90%以上。并且所有的SNP检测软件的SNP检测正确率都在97%以上，完全满足科研工作中的需求。结论：总的来说，本次研究推荐的测序策略为7X测序深度，250bp测序reads长度，在获得数据后的SNPcalling过程中，本次研究推荐使用多种SNPcalling软件组合的方法，以便获得最优的结果，方便后续的对基因组的分析。收起

关键词 : 二代测序测序技术 SNP检测测序策略分子标记

3. 宏基因组测序技术在假体周围感染诊断中的应用

[学位论文] 王超鑫福建医科大学 2021年硕士导师: 张文明共37页

摘要 : 第一部分:根据宏基因组二代测序技术结果治疗培养阴性人工关节感染的临床疗效目的:本研究的目的是评估基于宏基因组二代测序技术测序结果的靶向抗生素方案治疗培养阴性假体周围感染的疗效和安全性,以及验证宏基因组二代测序技术在鉴定培养阴性假... 展开第一部分:根据宏基因组二代测序技术结果治疗培养阴性人工关节感染的临床疗效目的:本研究的目的是评估基于宏基因组二代测序技术测序结果的靶向抗生素方案治疗培养阴性假体周围感染的疗效和安全性,以及验证宏基因组二代测序技术在鉴定培养阴性假体周围感染致病病原体的准确性和可靠性. 方法:纳入本中心接受手术治疗的假体关节感染患者有97例,其中27例患者培养结果为阴性.在27例培养阴性假体周围感染患者中,有13例在2017年6月之前入院并接受经验性抗生素治疗,将其归类为EA(EmpiricalAntibiotic,经验性抗生素治疗)组,其余14例在2017年6月之后入院并接受了基于宏基因组二代测序技术测序结果的靶向抗生素方案,将其归类为TA(TargetedAntibiotic,靶向抗生素治疗)组.比较了两组的短期感染控制率,抗生素相关并发症的发生率和费用. 结果:EA组中的两名患者因初次翻修手术后出现伤口感染而进行了清创并延长了抗生素治疗的时间.TA组未观察到感染复发.但是,两组之间的感染控制率没有显着差异(83.33%vs100%,P=0.217).EA组(6例)的抗生素相关并发症病例多于TA组(1例),但差异无统计学意义(P=0.0697).EA组获得的抗生素费用为20,168.37元(3236.38–45,297.16),高于TA组(10,164.16元,2959.54–16,661.04,P=0.04). 结论:基于宏基因组二代测序技术结果的靶向抗生素治疗培养阴性假体周围感染具有良好的效果,并且宏基因组二代测序技术是鉴定与培养阴性假体周围感染致病微生物的可靠工具. 第二部分:宏基因组三代测序技术检测人工关节感染病原菌的初步研究目的:病原学诊断对于假体周围感染(ProstheticJointInfection,PJI)的诊断和治疗至关重要.尽管培养方法是PJI中病原学诊断的基础,但假阴性结果经常发生.ONS(OxfordNanoporeSequencing,牛津纳米孔测序)无需培养即可快速检测临床样本中病原微生物核酸,并提供有关其相关AMR(AntimicrobialResistance,抗菌素耐药性)信息. 方法:为了评估mONS(MetagenomicOxfordNanoporeSequencing,宏基因组纳米孔测序)从PJI样本中检测病原体的能力,纳入于我院生物样本库内根据改良的MSIS(MuscularSkeletalInfectionSociety,骨骼肌肉感染学会)标准明确诊断髋、膝关节PJI9例患者,共15个骨关节样本.并对其同时进行了mNGS(MetagenomicNext-generationSequencing,宏基因组二代测序)和mONS.然后使用内部开发的生物信息学管道分析从两个平台生成的测序数据,以进行病原体鉴定和AMR检测. 结果:15份标本均培养阳性.ONS从12例培养阳性样本中均检出与培养一致的病原菌,平均测序时间为14.3h.ONS未能在3份样本中检出与培养一致的病原菌.mNGS从15例培养阳性样本中均检出与培养一致病原菌,平均测序时间为14.3h.对于AMR分析,mNGS测序从三个样本中检测到三个AMR读取,平均覆盖率为66.20%,mONS从五个样本中检测到331304个AMR读取,平均覆盖率为99.99%.ONS检出的原始病原列表中的可疑背景微生物种类与mNGS显著不同. 结论:我们初步证明了mONS可直接从PJI样本中快速,准确检出病原菌,但ONS的病原总体检出率低于传统培养及mNGS.ONS对硬件设备要求相对低,在不具备NGS检测平台的医疗机构中,ONS可作为培养方法的补充,快速检测PJI的病原菌及耐药基因. 收起

关键词 : 假体周围感染宏基因组测序二代测序

4. 蝙蝠病毒组学及潜在威胁病毒发现

[学位论文] 王宇洋北京协和医学院 2023年博士导师: 金奇共118页

摘要 : 近二十年来，人类社会遭遇了多次由病毒性病原体引起的疫情，如甲型流感病毒(InfluenzaAvirus)、尼帕病毒(Nipahvirus)、严重急性呼吸综合征(SevereAcuteRespiratorySyndrome,SARS)病毒、中东呼吸综合征(MiddleEastRespiratorySyndrome,MERS)病毒、埃... 展开近二十年来，人类社会遭遇了多次由病毒性病原体引起的疫情，如甲型流感病毒(InfluenzaAvirus)、尼帕病毒(Nipahvirus)、严重急性呼吸综合征(SevereAcuteRespiratorySyndrome,SARS)病毒、中东呼吸综合征(MiddleEastRespiratorySyndrome,MERS)病毒、埃博拉病毒(Ebolavirus)、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、猴痘病毒(Monkeypoxvirus)等。这些疫情不仅消耗了大量的社会资源，还引发了人们的恐慌甚至造成了病例的死亡，对人类社会构成了一大威胁。许多流行的病毒性病原体都是来源于野生动物的，这些病毒在野生动物宿主和家畜之间的跨种传播事件很难被观察到。但是它们有可能直接感染人类，因此有必要持续开展针对病毒自然宿主及其生态圈内相关动物的病毒组学研究。在众多可能的病毒自然宿主中，分布广泛、种类丰富的翼手目动物(蝙蝠)在SARS和新冠疫情的双重影响下，成为了病毒学研究领域最受关注的对象。我国是一个物种资源丰富的国家，目前已经发现了141种蝙蝠。通过基于二代测序技术的病毒组学方法，国内已经开展了十多年的蝙蝠病毒组学研究，但是由于采样点分布不均、样本数量不足、测序技术有限等原因，蝙蝠携带病毒的本底数据仍有缺失。为获取蝙蝠携带病毒的本底特征数据，实现对具有潜在威胁病毒的早期预警,降低其可能造成的危害。本研究以我国丰富的蝙蝠物种资源为基础，对2016到2021年间在我国14个省份采集的8个科50余种蝙蝠共13105个蝙蝠样本进行了病毒组学研究与冠状病毒筛查。在1140余份冠状病毒阳性样本中没有发现与SARS-CoV-2相关的冠状病毒，表明SARS-CoV-2相关冠状病毒在中国蝙蝠中的传播可能是有限的。测序数据进行拼接和比对后获得了大量的病毒contigs,其中长度1000bp以上的病毒序列76186条。经过对其中脊椎动物病毒进行注释和系统进化分析，结果涵盖了大部分的脊椎动物相关病毒科。这些病毒序列扩展了已鉴定的病毒的遗传多样性，还包含了大量新型病毒序列信息，例如菊头蝠携带的痘病毒、伏翼蝠和菊头蝠以及蹄蝠携带的瘟病毒、鼠耳蝠携带的丝状病毒、果蝠携带的捷申病毒和蝙蝠泡沫病毒等。由于《人间传染的病原微生物名录》和《一、二、三类动物疫病病种名录》涵盖了人间和动物间传播的重要病原体，因此对与名录中存在较近亲缘关系的分类学单元，作为潜在威胁病原体进行重点关注和进一步的分析研究。例如黄病毒科的丙型肝炎病毒属和瘟病毒属、小RNA病毒科的甲型肝炎病毒属、副肠孤病毒属、萨佩罗病毒属、捷申病毒属、痘病毒科成员和丝状病毒科成员等。通过对瘟病毒属与蝙蝠戊型肝炎病毒属进化历史中跨种传播事件的预测分析，发现蝙蝠不仅是病毒的“捐赠者”，也常常作为病毒的“获取者”，因此后续需要客观研究蝙蝠在各种病毒传播中的角色。本研究获得了大量蝙蝠携带病毒的序列数据，丰富了蝙蝠携带病毒数据库，还有助于提前预警潜在威胁病毒性病原体，切实为我国传染病防控和公共卫生工作提供数据支撑。收起

关键词 : 蝙蝠病毒组学二代测序技术

5. 噬菌体展示环肽库的开发与应用

[学位论文] 曹佳文中国科学院大学 2021年硕士导师: 熊兵共113页

摘要 : 近年来临床前及临床在研的环肽类药物数目呈现持续增加态势，鉴于环肽药物在治疗肿瘤、抗感染等疾病方面具有广泛应用前景，已成为研究人员新关注的重点领域。环肽药物的研发过程中首当其冲的一点便是如何高效快速的获得较好的苗头肽。除了从天然产物... 展开近年来临床前及临床在研的环肽类药物数目呈现持续增加态势，鉴于环肽药物在治疗肿瘤、抗感染等疾病方面具有广泛应用前景，已成为研究人员新关注的重点领域。环肽药物的研发过程中首当其冲的一点便是如何高效快速的获得较好的苗头肽。除了从天然产物及其衍生物中寻找有效的环肽苗头化合物外，利用生物技术构建多样性高质量文库进行高通量筛选发现全新环肽，也是有效手段。其中，噬菌体展示技术凭借其发展成熟、操作简单、快速高效等特点受到越来越多研究人员的认可，被广泛应用于抗体及多肽等分子的展示，是用于药物发现的有力工具。本论文主要围绕噬菌体展示技术开展研究。通过化学试剂自主构建高库容，多样性的噬菌体展示双环肽库，并通过将双环肽库及二硫键氧化成环的噬菌体展示单环肽库分别应用于两种靶点进行淘筛，以期掌握构建噬菌体展示环肽库的技术以及在应用噬菌体展示环肽库进行亲和淘筛方面积累一些经验。论文工作的第一部分首先是噬菌体展示双环肽库的构建。采用噬菌粒载体构建噬菌体文库，设计了在pⅢ基因中插入随机编码8个氨基酸的cDNA的噬菌粒pComb3XSS-CX4CX4C，其中，C指固定位置的半胱氨酸，X为20种天然氨基酸的其中一种。将噬菌粒通过多次高压电转，再借助辅助噬菌体M13K07进一步完成包装构建完整噬菌体展示文库。用TCEP处理未经修饰的噬菌体初库确保无二硫键形成，然后添加化学试剂1，3，5-三（溴甲基）苯(TBMB)于30℃水浴1h温和条件下与三个固定位置的自由巯基环化反应，成功构建1010pfu噬菌体展示双环肽库。其次是对噬菌体展示环肽库的淘筛应用。淘筛方案的探索也将帮助我们更好的理解并应用噬菌体文库，为后续研究提供必要的经验。为此，我们选择将构建的噬菌体展示双环肽库及商业可获得的噬菌体展示单环肽库应用于靶向新型免疫类靶点IL-22及表观遗传靶点WDR5的亲和淘筛，以积累更多的筛选经验。 IL-22是IL-10家族的一员，研究表明其与心血管疾病、免疫相关疾病息息相关。但目前关于直接作用于IL-22的药物的研究较少，选择靶向IL-22获得高结合力的环肽配体将有助于揭示其功能和研发创新药物。我们将自主构建的噬菌体展示双环肽库进行三轮磁珠悬浮液相淘筛，经一代测序及二代测序结果分析比对，最终挑选合成了4条双环肽序列，将phD.-C7C二硫键成环的噬菌体展示单环肽库分别进行差减淘筛及磁珠交替淘筛，最终参考一代测序结果挑选合成了18条单环序列。对这些环肽序列进行活性测试，发现序列D206063(CPNLSNVSC)、D206070(CLARLTRSC)及D206074(CIPRGVLNC)经ITC鉴定分别为2.9±1.0μM、4.1±2.0μM、4.9±2.1μM，但细胞水平的测试表明仅在高浓度500μM时观察到环肽D206070(CLARLTRSC)及D206074(CIPRGVLNC)对IL-22诱导STAT3磷酸化有抑制效果。鉴于此，我们又选择了相对研究较为深入的表观遗传靶点WDR5进行淘筛，该部分内容已总结发表。WDR5隶属于WD40家族，含有7个WD结构模块，参与基因表达的调节，与多种蛋白形成复合物调控基因转录相关过程，是目前肿瘤治疗的热门靶点。我们采用相同的二硫键成环的噬菌体展示单环肽库phD.-C7C以同样条件投入淘筛，进行3轮及5轮淘筛，并对相应的淘筛结果都进行一代测序分析。经序列比对发现其序列一致性非常高，大多数序列均含有“RT”基序，最终选择合成5条环肽序列，利用FP荧光偏振方法对其进行鉴定，其中环肽化合物CRTLPWNNC结合亲和力最高（EC50=2.3±0.6μM）。随后采用悬滴式蒸汽扩散法进行蛋白-环肽化合物共晶实验，成功获得D206115(CRTLPFHEC)与WDR5的蛋白共晶晶体，经X-射线衍射后进行结构解析，进一步证实了精氨酸作为关键氨基酸对于结合的重要性。本课题研究中，我们成功构建了高库容、多样性的双环肽库，并且在针对两种不同类型的靶点亲和淘筛过程中，积累了一些淘筛经验，为后续研究提供了基础。同时本论文的研究结果也为研究噬菌体展示环肽技术以及对免疫靶点IL-22或者表观遗传靶点WDR5等进行研究的同行提供了一些参考。收起

关键词 : 噬菌体展示环肽二代测序

6. 基于NGS的胃癌外周血环状RNA筛选及验证

[学位论文] 向首艳江苏大学 2021年硕士导师: 范钰共70页

摘要 : 目的：胃癌的发病率和死亡率很高，早期发现对改善胃癌的预后具有重要意义。但目前应用于临床的肿瘤标志物敏感性均较低，需要发现新的肿瘤分子标志物。二代测序技术和生物信息学分析技术的的发展，为临床发现分子标志物带来了希望。环状RNA是目... 展开目的：胃癌的发病率和死亡率很高，早期发现对改善胃癌的预后具有重要意义。但目前应用于临床的肿瘤标志物敏感性均较低，需要发现新的肿瘤分子标志物。二代测序技术和生物信息学分析技术的的发展，为临床发现分子标志物带来了希望。环状RNA是目前研究热点。然而目前采用二代测序技术研究胃癌外周血circRNA的研究甚少。为此，本研究对不同类型的胃癌外周血中circRNA进行筛选、验证，拟为胃癌精准医疗提供新的靶点和思路。方法：收集20例包含肠型胃癌、弥漫型胃癌患者外周血与10例健康正常人外周血，利用二代测序技术分别分析了差异表达的circRNA表达谱，并对差异表达circRNA亲本基因生信进行研究，分析GO和KEGG通路等信息。然后，以差异表达倍数大于2为标准，从上调倍数大于2的分子中随机选择两个circRNA，采用Sanger测序验证其环状分子成环性，然后扩大临床样本量，采用qRT-PCR研究目标分子在胃癌患者中表达情况及临床意义。结果：（1）利用二代测序技术我们在肠型胃癌、弥漫型胃癌组筛选出表达上调的circRNA数量分别为9299、9920条，表达下调circRNA数量分别为2410、2406条，以差异表达倍数大于2为筛选条件，肠型胃癌、弥漫型胃癌差异表达上调circRNA数量分别为3643、5665条，差异表达下调circRNA数量分别为1348、1347条。（2）进一步对差异表达的circRNA的亲本基因进行GO分析和KEGG通路分析，结果显示肠型胃癌中差异上调circRNA亲本基因富集较多的生物过程、分子功能、细胞组分分别是细胞迁移（GO:0016477）、跨膜受体蛋白酪氨酸磷酸酶活性（GO:0005001）、突触后膜（GO:0045211）等；在弥漫型胃癌中，差异上调circRNA亲本基因富集较多的生物过程、分子功能、细胞组分分别是轴突引导（GO:0007411）、ATP结合（GO:0005524）、细胞连接（GO:0030054）等；两种类型胃癌差异下调circRNA共同来源的亲本基因GO分析显示其亲本基因参与较多的生物过程、分子功能、细胞组分分别是磷脂酰肌醇介导的信号传导（GO:0048015）、电压门控的钙通道活性（GO:0005245）、电压门控钙通道复合物（GO:0005891）。pathway分析提示在肠型胃癌中差异上调circRNA亲本基因参与的相关通路主要包括Rap1信号通路（hsa04015）、粘着斑（hsa04510）、癌症的路径（hsa05200）等；在弥漫型胃癌中，差异上调circRNA亲本基因主要参与的通路为轴突引导（hsa04360）、粘着斑（hsa04510）、钙信号通路（hsa04020）等。两种类型胃癌差异下调circRNA亲本基因参与的主要通路包括谷氨酸性突触（hsa04724）、胆碱能突触（hsa04725）、癌症中的蛋白多糖（hsa05205）。（3）对随机选择的circRNAcirc-chr10：42392303-42396909-、circ-chr1：121484567-121484906-，Sanger测序验证了其成环性。qRT-PCR检测发现，circ-chr10：42392303-42396909-在90例胃癌患者外周血中呈高表达，且与患者淋巴结转移、远处转移、TNM分期有关，而与性别、年龄、肿瘤直径、组织分化、CEA表达水平无关。结论：（1）利用二代测序技术，发现了胃癌外周血中的circRNA差异分子表达谱。（2）肠型胃癌、弥漫型胃癌下调的circRNA的相关通路基本一致，主要包括谷氨酸性突触（hsa04724）、胆碱能突触（hsa04725）、癌症中的蛋白多糖（hsa05205），但是，肠型胃癌、弥漫型胃癌上调的circRNA涉及到的通路明显不同。（3）本研究发现，circ-chr10：42392303-42396909-高表达与淋巴结转移（p=0.041）、远处转移（p=0.027）、TNM分期（p=0.025）有关，可能为胃癌一个潜在分子标志物。收起

关键词 : 胃癌外周血环状RNA 二代测序

7. 二代测序鉴定胃癌基因突变

[学位论文] 王珍珍河南科技大学 2016年硕士导师: 王公平共79页

摘要 : 胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率在所有肿瘤中排第四位，在癌症所致的死亡中胃癌引起的死亡居于第二位。胃癌在我国的发病率和死亡率较高，胃癌严重影响我国人民的健康甚至生命。胃癌的发生过程是一个多因素的、多环节的、多个基因共同... 展开胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率在所有肿瘤中排第四位，在癌症所致的死亡中胃癌引起的死亡居于第二位。胃癌在我国的发病率和死亡率较高，胃癌严重影响我国人民的健康甚至生命。胃癌的发生过程是一个多因素的、多环节的、多个基因共同参与的复杂过程，为胃癌的诊断及治疗带来了极大的困难。目前胃癌的治疗方法主要包括：根治性手术、化学疗法及生物治疗。其中手术治疗是胃癌治疗的主要方法，目前胃癌患者预后差源于多数患者在就诊时已处于进展期，失去手术最佳时机，从而在一定程度上影响了治疗效果，因此，目前关于胃癌早期诊断、易感基因、治疗靶点的研究已成为胃癌研究的热点。积极探索与胃癌发生发展相关的分子生物标记和治疗靶点，有助于为胃癌的诊断治疗提供新的方法。二代测序技术的出现和发展为肿瘤研究人员提供了强有力的新工具，极大地提高了基因组的测序通量，为解开肿瘤复杂庞大的基因变异开辟了新的途径。目的：为了在分子水平发现与胃癌发生发展相关的基因变异，发现胃癌中潜在的高频突变基因，为发现胃癌发生发展中相关的分子标记和潜在的治疗靶点提供理论依据。方法：胃癌组织样本由实验员携带便携式液氮罐于手术室收集，编号后转送至-80℃超低温冰箱中存放备用。在肿瘤体细胞变异目录数据库上筛选出与肿瘤相关的基因，利用二代测序平台对胃癌组织进行了291个肿瘤相关基因的靶向深度测序，对测序得到的数据进行处理和分析，与千人基因组计划数据库比对，得到胃癌患者中的高频变异基因，进一步进行基因富集通路分析及高频变异位点在胃癌患者中的临床病理意义。结果：经检测发现，胃癌样本的突变位点主要分布于外显子及内含子区域，突变位点对应的功能主要为非同义单核苷酸变异及同义单核苷酸变异。平均每个样本中存在407个单核苷酸变异（其中包含233个同义突变和174个非同义突变）和9个插入缺失变异。经过筛选过滤发现，在148个基因中存在非同义突变，其中77个基因在两个或两个以上的样本中存在变异。突变率较高的基因有TTN，ALK，MUC2，MCC，ATR，SPRR2B，CASP7，PRKDC，NEMF，TP53，FAT4，CYP2B6，FMN2。变异基因所富集的通路如p53 signaling pathway,TGF-βsignaling,apoptosis以及Nucleotide excision repair等信号通路，这些信号通路可能与胃癌的发生机制存在一定的相关性。本研究未发现高频变异位点与胃癌患者的临床病理特征存在明显的相关性。结论： 1.胃癌组织中的高频突变基因为TTN，ALK，MUC2，MCC，ATR，SPRR2B，CASP7，PRKDC，NEMF，TP53，FAT4，CYP2B6，FMN2等，其中TTN，SPRR2B，PRKDC，NEMF，CYP2B6以及FMN2基因可能是胃癌中新的变异基因。 2.变异基因所富集的通路主要为p53 signaling pathway,TGF-βsignaling,apoptosis等。 3.未发现TTN rs12693166，rs2627043；ALK rs3795850，rs1881420；MUC2 rs2856111，rs56365200这些高频突变位点与胃癌临床病理存在相关性。收起

关键词 : 胃癌基因突变二代测序靶向深度测序临床病理

8. 一种不依赖于spike-in的mRNA定量测序技术siqRNA-seq

[学位论文] 王珍珍郑州大学 2023年硕士导师: 李亚兵；徐炜共69页

摘要 : 转录组是指特定组织或细胞在一定生理条件下的全部转录本。对转录组的解析可以全面地检测生物样本基因组中活跃基因的表达水平变化情况，揭示其功能。RNA-seq是目前最常用的转录组检测技术，其中绝对定量RNA-seq可以直接反映每个基因的RNA绝对数量，可... 展开转录组是指特定组织或细胞在一定生理条件下的全部转录本。对转录组的解析可以全面地检测生物样本基因组中活跃基因的表达水平变化情况，揭示其功能。RNA-seq是目前最常用的转录组检测技术，其中绝对定量RNA-seq可以直接反映每个基因的RNA绝对数量，可以更加真实地反映基因表达水平，是基因定量转录组研究的关键技术。目前转录组定量方法主要有两种:一是以管家基因作为内参;二是依靠掺入外源spike-in。然而这两种方法有其局限性:当细胞处于不同的生长阶段或生长条件下，其管家基因的表达并不能保持绝对稳定，导致了依赖管家基因的转录组定量技术准确性和稳定性不足;基于外源spike-in的方法虽然可以提供RNA分子的绝对量，但在大多数研究中，研究人员关注的是每个细胞的RNA含量，因此还需要对样本中的细胞进行计数，耗时费力且很多样本因质地坚硬、包埋等原因导致其细胞数难以精准统计。这些技术缺陷限制了定量转录组研究的开展。针对上述问题，本研究开发出了一种新的绝对定量转录组的测序技术——siqRNA-seq。作为一种不依赖于spike-in的RNA定量测序方法，该方法可以评估每个细胞或每套基因组中表达出的mRNA的拷贝数，且无需细胞计数或RNA定量。为了量化mRNA的表达水平，siqRNA-seq构建了纯RNA文库和总核酸文库，并建立量化模型计算出mRNA拷贝数。基于这项新技术检测了HEK293T、IOSE-80和HCT116这三种细胞系每套基因组中表达的总mRNA拷贝数，并通过RT-qPCR技术验证了siqRNA-seq定量的准确可靠。接下来，将siqRNA-seq技术应用在放线菌素D对HEK293T细胞基因表达影响的研究中，准确识别出了处理后总体mRNA水平的变化情况，并且还发现mRNA的降解速率主要与是否存在m6A修饰有较强关联。该方法可以使研究者能够便捷且准确地评估每套基因组或每个细胞的mRNA拷贝数，并且通过该技术可以避免相对定量导致的基因表达差异被错误估计或低估的现象。该技术提供了一套简洁通用的方法来定量分析各种类型样本中的mRNA情况，大幅度拓展定量转录组的研究领域。收起

关键词 : 转录组基因表达 RNA测序二代测序 spike-in

9. OnePGT技术在胚胎植入前遗传学检测中的应用研究

[学位论文] 李莉南方医科大学 2020年博士导师: 陈士岭共125页

摘要 : 染色体异常包括倍数改变、非整倍性改变、结构改变和微小片段重复和缺失。染色体异常是造成人类胚胎低着床率、妊娠丢失和出生缺陷的重要原因。胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing，PGT)技术可有效地提高胚胎种植率和妊娠率，降低... 展开染色体异常包括倍数改变、非整倍性改变、结构改变和微小片段重复和缺失。染色体异常是造成人类胚胎低着床率、妊娠丢失和出生缺陷的重要原因。胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing，PGT)技术可有效地提高胚胎种植率和妊娠率，降低流产率，防止遗传性疾病患儿的出生。PGT包括三个方面的检测，植入前胚胎单基因遗传学检测(PGT for monogenic/single genedefects，PGT-M)、植入前胚胎染色体结构变异遗传学检测(PGT for chromosomalstructural rearrangement，PGT-SR)和胚胎植入前遗传学筛查(PGT for aneuploidy，PGT-A)。多种分子生物学技术和分子遗传学技术可用于染色体遗传检测和分析，包括FISH技术、PCR技术、aCGH技术、SNP-array技术和NGS技术。到目前为止，没有一项技术可以在一个工作流程里用一组试剂完成三种染色体异常的检测和分析，同时达到区分染色体平衡易位者的正常型胚胎和易位携带型胚胎。因此确立了本研究:探索OnePGT技术在胚胎植入前遗传检查中的意义和价值。目的: 1.验证OnePGT检测方法同时检测胚胎单基因疾病、染色体结构重排和非整倍体的可行性和可靠性。 2.明确OnePGT方法同时区分染色体平衡易位携带型和正常型胚胎的有效性和准确性。 3.为临床PGT诊断建立一种新的、综合性、有效性的检测方法。方法: 收集2018年3月7日至2018年11月1日在广州医科大学附属第三医院生殖医学中心行PGT-M的7个家系20个胚胎和PGT-SR的5个家系11个胚胎重新活检，以及父母的血样。 1.单基因疾病检测:20个胚胎样本（对照7个）和父母DNA样本扩增，全基因组建文库，测序，获得对照胚胎致病基因位点+/-2Mb的SNP数据和父母样本的SNP数据，比对待测胚胎致病基因位点+/-2Mb的SNP数据，判别胚胎是否携带致病基因，与原结果比较OnePGT技术检测单基因疾病的可行性和准确性。 2.染色体结构重排检测:11个胚胎（对照4个）和父母NDA样本经扩增，全基因组建文库，测序，获得对照胚胎染色体异常位点+/-2Mb的SNP数据、父母样本SNP数据，比对胚胎染色结构异常位点+/-2Mb的SNP数据明确胚胎的携带型或正常型，与原结果比较OnePGT技术检测染色体结构重排的可行性和准确性。 3.非整倍体检测:同时获取以上所有胚胎样本非整倍体结果，与原结果比较OnePGT技术检测非整体的准确率，嵌合体符合程度以及三体的起源。结果: 1.OnePGT方法检测的三种单基因疾病（α-地中海贫血、β-地中海贫血和脊髓性肌萎缩）胚胎遗传结果与原方法结果比较，完全一致。 2.OnePGT方法检测的染色体相互易位和罗氏易位患者的胚胎遗传结果与原方法的结果完全一致，区分染色体易位携带型和正常型的符合率100％。 3.OnePGT检测的非整倍体异常率72％，原方法检测非整体异常率88％，中度一致，嵌合体一致率50％;4个胚胎的三体均由减数分裂Ⅰ的分离错误导致。结论: 1.OnePGT实现了一个操作流程里同一套试剂对三种染色体异常（单基因疾病、染色体结构重排和非整体）的检测和诊断; 2.OnePGT可以区分染色体平衡易位者的正常胚胎和易位携带胚胎; 3.OnePGT可以判断染色体三体错误的起源; 4.OnePGT是一种新型、综合、有效的三合一式的植入前遗传学检测方法。收起

关键词 : 胚胎植入遗传学检测二代测序

10. 二代测序在肺部感染性疾病中的应用价值研究

[学位论文] 陈玲南华大学 2020年硕士导师: 蒋永亮共84页

摘要 : 目的: 探讨肺泡灌洗液中二代测序(Next-generation sequencing NGS)在合并有基础疾病、存在免疫抑制及发展为重症肺炎的肺部感染患者中的微生物分布、病原学诊断及对临床诊疗策略的影响等方面的应用价值。方法: 回顾性分析2018年8月-... 展开目的: 探讨肺泡灌洗液中二代测序(Next-generation sequencing NGS)在合并有基础疾病、存在免疫抑制及发展为重症肺炎的肺部感染患者中的微生物分布、病原学诊断及对临床诊疗策略的影响等方面的应用价值。方法: 回顾性分析2018年8月-2019年12月湖南省人民医院呼吸与危重症医学科临床诊断为肺部感染，并完善了支气管镜和NGS检查的116例患者的临床资料，根据入选标准与排除标本纳入合并基础疾病的患者63例，合并免疫抑制状态的患者13例，发展为重症肺炎的患者28例，结合临床资料对其肺泡灌洗液NGS结果进行分析。结果: 在三种不同特征的肺部感染患者的微生物分布中，细菌分布无明显差异，均以链球菌属、韦荣球菌属为主；真菌分布中念珠菌属在三者中都占据主要地位，但在合并免疫抑制患者中肺孢子菌属最常致病；在三种不同特征的肺部感染患者中EB病毒检出率均为最高，但在重症肺炎患者中腺病毒的致病率最高。相较于传统实验室培养，NGS在三种不同特征肺部感染的病原体阳性率中均显示出优势：伴有基础疾病患者(66.67%vs19.05%，p＜0.001))，合并免疫抑制患者(69.23%vs15.38%，P=0.015)，发展为重症肺炎的患者(78.57%vs32.14%，P=0.001)，三者均有统计学意义，但对于三种不同特征的肺部感染患者中NGS阳性率之间的差异无统计学意义(66.67%vs69.23%vs78.57%P=0.517)。另外，本研究发现NGS结果在合并基础疾病及发展为重症肺炎的肺部感染患者中对临床治疗策略具有重要的指导意义(38.10%、53.57%)，相比之下，在合并免疫抑制的肺部感染患者中仅23.08%的患者导致了治疗策略的改变，三者在导致临床治疗策略改变之间的差异有统计学意义(38.10%vs53.57%vs23.08%，P=0.001) 结论: 1.在三种不同特征的肺部感染患者的微生物分布中，细菌分布无明显差异，均以链球菌属、韦荣球菌属为主；真菌中都显示念珠菌属占据重要地位，但合并免疫抑制患者中肺孢子菌属最常致病；在三者中EB病毒检出率均为最高，但在重症肺炎中腺病毒致病率最高。 2.NGS在三种不同特征的肺部感染患者中均具有优于传统实验室培养的病原学诊断意义，尤其在合并基础疾病及重症肺炎患者中。 3.相比于合并免疫抑制，NGS结果对于合并基础疾病及发展为重症肺炎的肺部感染患者的治疗策略更具有指导意义。收起

关键词 : 肺部感染肺泡灌洗液二代测序