摘要: 本文从以下几个方面进行论述： 第一部分内容：在临床患者中，cfDNA与HMGB1参与体外循环后的免疫炎症反应 研究目的：免疫炎症反应在心肌缺血再灌注损伤的研究中越来越受到广泛关注。目前实验研究已经证实，组织损伤或者严重炎症反应后可以释放... 展开 本文从以下几个方面进行论述： 第一部分内容：在临床患者中，cfDNA与HMGB1参与体外循环后的免疫炎症反应 研究目的：免疫炎症反应在心肌缺血再灌注损伤的研究中越来越受到广泛关注。目前实验研究已经证实，组织损伤或者严重炎症反应后可以释放大量的高迁移率族蛋白-B1（HMGB1）及循环游离DNA（cfDNA），二者均可以激活机体炎症反应，其中cfDNA通过TLR9激活下游信号，HMGB1通过HMGB1-RAGE通路加重全身炎症反应。临床中，CPB患者常常出现术后心肌缺血再灌注损伤，然而CPB中，HMGB1及cfDNA是否参与其介导的炎症反应尚不明确。本部分研究内容，拟讨论在CPB临床患者中，HMGB1及cfDNA是否在心肌缺血再灌注中同样发挥了重要作用。 研究内容及方法：在临床中，随机选取20名经过体外循环（CPB）的患者，收集患者相关的临床信息。在临床研究中，利用心内直视手术心外循环的模型，模拟心肌缺血再灌注损伤；并在手术过程中体外循环前30min，抽取患者动脉血液标本，在体外循环结束后30min，再次抽取患者动脉血液标本，并将两次血液进一步提取血浆。使用血浆cfDNA提取试剂盒，提取血浆中的cfDNA；通过Qubit assays对比血浆中cfDNA水平变化，通过ELISA对比血浆中HMGB1的水平变化，通过ELISA对比血浆中的炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）的水平变化；通过WB检测血浆中HMGB1的表达差异。通过统计学方法比较体外循环前后，cfDNA、HMGB1及炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）水平的变化差异。 研究结果：Qubit assays结果显示：患者体外循环术后30min的血浆cfDNA水平明显高于体外循环前30min水平（体外后38.34±12.87ng/mL vs体外前17.01±6.46ng/mL，p＜0.05）。ELISA显示：在体外循环后30min的血浆HMGB1表达水平显著高于体外循环前30min，（体外后28.42±6.21ng/mL vs体外前12.24±3.64ng/mL，p＜0.05）；同样，在WB实验中外循环术后的血浆的HMGB1表达水平高于体外循环前。同时，在体外循环后30min的血浆IL-1β（体外后119.2±36.31pg/mL vs体外前44.6±20.35pg/mL，p＜0.05）、TNF-α（体外后512.08±142.41pg/mL vs体外前297.72±90.44pg/mL，p＜0.05）、IL-6（体外后248.58±75.91pg/mL vs体外前125.56±31.23pg/mL，p＜0.05）表达水平显著高于体外循环前30min水平。在CPB患者术后30min的动脉血浆中，长时间CPB血浆中cfDNA、HMGB1及炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）含量明显高于短时间CPB， 结论：在临床研究中，cfDNA与HMGB1在CPB中发挥重要作用。在CPB患者术后30min动脉血浆中cfDNA与HMGB1显著升高；同时，炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）也显著增加。在CPB患者术后30min的动脉血浆中，cfDNA、HMGB1及炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）的升高与患者的CPB时间明确相关，与患者的性别、年龄、BMI无关。 第二部分内容：心肌缺血再灌注后，cfDNA-HMGB1激活外周血单核细胞NLRP3炎症复合体，加剧再灌注心肌损伤 研究目的：近年来，心肌缺血再灌注免疫损伤成为研究热点问题。目前研究发现心肌缺血后产生大量细胞因子等促炎物质，导致多种免疫细胞聚集活化，促进心肌局部及全身免疫炎症反应，加重心肌损害。我们课题组在内的多项研究发现，单核巨噬细胞在心肌缺血再灌注后激活的机体免疫炎症反应中，发挥重要作用；通过抑制外周血单核巨噬细胞的炎症反应，减轻缺血再灌注后的炎症反应，改善心脏功能。NLRP3炎症复合体在通过活化IL-1β激活无菌性炎症反应过程中的作用受到极大关注。近来研究发现，NLRP3炎症复合体在心肌缺血再灌注损伤过程中发挥重要免疫调控作用。但心肌再灌注损伤过程中免疫细胞中炎症复合体的详细调控机制仍不清楚。 此部分研究内容，通过小鼠的心肌缺血再灌注模型，检测小鼠血液中cfDNA、HMGB1及炎症因子的变化，并研究其作用机制。 研究内容及方法：利用C57BL6野生型（WT）小鼠构建心肌缺血再灌注模型（缺血40min，再灌注10min）。实验分组：假手术组（Control组，共10只），经行开胸手术，未结扎冠脉及再灌注损伤，术后50min处理小鼠；缺血再灌注组小鼠（IR组，共10只）行全麻下呼吸机辅助下开胸，结扎冠脉40min，后再灌注10min；缺血再灌注组小鼠+Anti-HMGB1（Anti-HMGB1组，共10只）行心肌缺血手术+再灌注前使用HMGB1拮抗剂处理（1mg/g）；缺血再灌注组小鼠+DNaseI（DNaseI组，共10只）行心肌缺血手术+再灌注前使用DNaseI（30mU/g）处理；20’/10’缺血再灌注组小鼠（20’/10’IR组，共5只）行全麻下呼吸机辅助下开胸，结扎冠脉20min，后再灌注10min；20’/10’缺血再灌注组小鼠+cfDNA处理（20’/10’IR+cfDNA组，共5只）结扎冠脉20min，再灌注10min，再灌注前使用人工提取的cfDNA处理（尾静脉注射人工提取cfDNA，20ng/g）；20’/10’缺血再灌注组小鼠+rHMGB1处理（20’/10’IR+rHMGB1组，共5只）结扎冠脉20min，再灌注10min，再灌注前使用外源性重组rHMGB1处理（尾静脉注射rHMGB1，50ng/g）；20’/10’缺血再灌注组小鼠+cfDNA+rHMGB1处理（20’/10’IR+Treatment组，共5只）结扎冠脉20min，再灌注10min，再灌注前使用人工提取的cfDNA与外源性重组rHMGB1处理（尾静脉注射cfDNA，20ng/g；rHMGB1，50ng/g）；20’/10’缺血再灌注组小鼠+cfDNA+rHMGB1+CY-09处理（20’/10’IR+Treatment+CY-09组，共5只）结扎冠脉20min，再灌注10min，再灌注前使用人工提取的cfDNA、外源性重组rHMGB1、CY-09共同处理（尾静脉注射cfDNA，20ng/g；rHMGB1，50ng/g；CY-09，50ug/g）。10组小鼠术后分别抽取血液，通过Ficoll—hypaque密度梯度离心法提取血浆、及血液中单核巨噬细胞；使用血浆cfDNA提取试剂盒，取血浆中的cfDNA；部分小鼠部分心肌行TTC染色，测量心梗面积。 研究结果：第一部分动物实验中，Qubit assays结果显示：IR组小鼠血浆中cfDNA水平明显高于Control组、DNaseI组（IR组253.6±82.28ng/mL vs Control组99.87±40.08ng/mL、DNaseI组23.11±15.05ng/mL，p＜0.05）。ELISA结果显示：在IR组的血浆中HMGB1表达水平显著高于Control组、Anti-HMGB1组，（IR组36.33±6.99ng/mL vs Control组12.23±3.47ng/mL、Anti-HMGB1组10.13±3.96ng/mL，p＜0.05）；同时，在IR组的血浆中IL-1β（IR组101.49±15.75pg/mL）、TNF-α（IR组385.58±74.89pg/mL）、IL-6（IR组238.84±62.06pg/mL）表达水平显著高于Control组（10.52±2.58pg/ml、84.49±38.3pg/ml、92.25±27.98pg/ml）、DNaseI组水平（62.44±24.88pg/ml、212.57±78.38pg/ml、152.58±69.77pg/ml）、Anti-HMGB1组（52.79±26.71pg/ml、175.8±33.12pg/ml、115.19±35.25pg/ml）。WB结果显示：IR组小鼠的外周血单核巨噬细胞中，NLRP3、IL-1β的含量明显高于Control组、DNaseI组、Anti-HMGB1组。Caspase1活性检测：IR组小鼠的外周血单核巨噬细胞中，Caspase1活性明显高于Control组、DNaseI组、Anti-HMGB1组。心肌梗死面积检测：IR组小鼠心梗面积明显高于Control组、DNaseI组、Anti-HMGB1组。PCR实验中显示，IR组小鼠血浆中cfDNA的COX-1与16S-RNA的表达量明显高于Control组。 结论：1.小鼠心肌缺血再灌注后，循环中cfDNA、HMGB1及炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）浓度明显升高；通过抑制cfDNA、HMGB1的浓度，减少外周血中单核巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化，进而降低机体的炎症因子含量，减轻机体炎症反应，改善小鼠心肌缺血再灌注损伤。2.小鼠心肌缺血再灌注后，循环中的cfDNA的主要来源与线粒体相关。3.在20’/10’缺血再灌注模型中，cfDNA及HMGB1二者共同作用外周血中单核巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化，增加机体的炎症因子表达，增加机体炎症反应，加重小鼠心肌缺血再灌注损伤。 收起