摘要: 本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 TCR-β-/-小鼠雾化吸入母牛分枝杆菌后的气道炎症反应 目的：探讨γδT细胞是否参与由雾化吸入母牛分枝杆菌引发的小鼠气道炎症及其特点，并制备小鼠脾脏γδT细胞悬液。 方法：将24只SPF级雄性TCR-β-/-... 展开 本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 TCR-β-/-小鼠雾化吸入母牛分枝杆菌后的气道炎症反应 目的：探讨γδT细胞是否参与由雾化吸入母牛分枝杆菌引发的小鼠气道炎症及其特点，并制备小鼠脾脏γδT细胞悬液。 方法：将24只SPF级雄性TCR-β-/-小鼠随机均分为2组：对照组和母牛分枝杆菌雾化组，每组12只。将两组小鼠分别置于雾化装置，对照组雾化采用10ml生理盐水，母牛分枝杆菌雾化组则将1支注射用母牛分枝杆菌制剂（22.5ug/瓶)溶解于10ml生理盐水雾化，两组均每天雾化20min，连续5天。最后一次雾化后24小时内取材。用苏木精—伊红（hematoxylin-eosinHE）染色法、过碘酸雪夫（PeriodicAcid-SchiffPAS）染色法观察小鼠肺部炎症情况；同时取脾脏并用磁珠分选法制取脾γδT细胞悬液，并用流式细胞术检测其纯度。 结果：HE染色显示对照组小鼠支气管形态规整，上皮细胞无增生，管壁无明显增厚，肺泡间隔正常，肺泡壁无水肿充血，支气管及血管周围无或少许炎性细胞浸润，母牛分枝杆菌雾化组小鼠支气管壁形态略不规整，上皮粘膜稍增厚，支气管及血管周围有较多炎性细胞浸润，支气管管腔较对照组狭窄、管壁增厚。PAS染色显示对照组气道无粘液渗出，杯状细胞少甚至无；母牛分枝杆菌雾化组可见气道杯状细胞增生和粘液渗出。免疫磁珠法分选后所获得的小鼠脾脏γδT淋巴细胞，其纯度经流式细胞仪检测均大于80%，可继续用于第二部分过继免疫实验。 结论：γδT细胞可能参与了由雾化吸入母牛分枝杆菌引起的气道炎症。免疫磁珠法可制备高纯度小鼠脾脏γδT细胞悬浮液。 第二部分 过继母牛分枝杆菌免疫的γδT细胞对小鼠哮喘模型的影响及机制研究 目的：探讨鼠尾静脉注射过继经雾化吸入母牛分枝杆菌免疫的γδT细胞是否能够预防哮喘及其预防哮喘的机制。 方法（1）制备TCR-β-/-小鼠脾脏γδT细胞悬浮液，详细操作方法见第一部分。（2）将32只SPF级雄性Balb/c小鼠随机均分为A、B、C、D4组，每组8只；A组为正常对照组，用PBS或生理盐水代替其它组的实验试剂进行干预，B、C、D组为常规哮喘模型组，用卵清蛋白(ovalbumin，OVA)构造哮喘模型，每组小鼠于第0天、7天和14天腹腔注射OVA-氢氧化铝悬液2ml/只（25μgOVA+1mg氢氧化铝凝胶混合于2mL磷酸盐缓冲液中（Phosphatebufferedsaline，PBS），第21-27天予以雾化吸入浓度为2%OVA+PBS缓冲液以激发形成哮喘模型；B组为哮喘免疫过继对照组，用生理盐水代替进行免疫过继对照；C组为TCR-β-/-小鼠生理盐水雾化后γδT细胞过继组（未经母牛分枝杆菌吸入免疫），在每次次腹腔注射的同时以及第21天开始雾化的同时，予以鼠尾静脉注射过继TCR-β-/-小鼠经生理盐水连续雾化5天后用磁珠分选提取的γδT细胞，每次鼠尾静脉注射106个γδT细胞，溶于1ml生理盐水中，过继2次；D组是TCR-β-/-小鼠母牛分枝杆菌雾化后γδT细胞过继组（经母牛分枝杆菌吸入免疫），在每次腹腔注射的同时以及第21天开始雾化的第一天，予以鼠尾静脉注射过继TCR-β-/-小鼠经母牛分枝杆菌连续雾化5天后用磁珠分选提取的γδT细胞，每次鼠尾静脉注射106个γδT细胞，溶于1ml生理盐水中，过继2次。末次雾化后24小时内测定气道反应性，之后取材用HE染色法和PAS染色法观察小鼠肺部炎症情况，免疫组化测定肺组织T-bet、GATA水平，ELSA法检测其支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）IL-13和IL-5水平。 结果：（1）肺组织病理切片结果显示：A组小鼠HE染色可见其支气管形态规整，上皮细胞无增生，管壁无明显增厚，肺泡间隔正常，肺泡壁无水肿、充血，支气管及血管周围无或少许炎性细胞浸润，PAS染色见气道上皮杯状细胞少或无，无明显粘液渗出；B组HE染色可见支气管壁形态不规整，管壁增厚，管腔狭窄，上皮粘膜明显增厚、断裂，支气管及血管周围较多炎性细胞浸润，肺泡间隔明显断裂，肺泡壁水肿充血，可见许多炎性细胞。PAS染色可见粘液渗出和杯状细胞增生明显。C组HE染色可见血管及支气管周围炎性细胞浸润少于B组。PAS染色示支气管管壁稍厚，粘液渗出和杯状细胞数量稍减少。D组HE染色可见支气管及血管周围炎性细胞浸润降低明显少于C组，肺泡壁无明显充血水肿。PAS染色可见支气管管壁厚度及管腔形态基本恢复，粘液渗出和杯状细胞增生不明显。各组小鼠气道炎症水平：B组＞C组＞D组＞A组（p＜0.05）。 （2）肺功能检测结果。 B组小鼠在6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml四个浓度的Mch激发后其气道反应性均高于A组小鼠(p＜0.05)；C组小鼠在6.25mg/ml和12.5mg/ml这两个浓度Mch激发后其气道反应性与A组小鼠相比无差异（p＞0.05），在25mg/ml和50mg/ml这两个浓度的Mch激发后其气道反应性高于A组小鼠（p＜0.05），C组小鼠在6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml四个浓度的Mch激发后其气道反应性均低于B组小鼠；D组小鼠在6.25mg/ml、25mg/ml、50mg/ml浓度的Mch激发后其气道反应性均低于C组小鼠（p＜0.05）。 （3）小鼠肺组织免疫组化结果 肺组织T-bet水平：A组：4.9?1.80、B组2.0?1.51、C组3.1?1.75、D组4.1?2.01，各组互相比较A＞D＞C＞B。A组小鼠肺组织T-bet主要表达于气道上皮细胞、气道周围及肺组织淋巴细胞等细胞胞浆和细胞核中。B组小鼠肺组织的T-bet表达强度明显低于A组，其表达范围也少于于A组(p＜0.05)。C组小鼠肺组织T-bet表达强度高于B组小鼠，表达范围明显大于B组小鼠(p＜0.05)；D组小鼠肺组织中的T-bet表达强度和表达范围与A组小鼠相比无明显差异(p＞0.05)，D组小鼠肺组织T-bet表达强度高于C组小鼠和表达范围明显大于C组小鼠(p＜0.05)。 肺组织GATA3水平：A组2.6?1.92、B组5.8?1.39、C组4.7?1.51、D组3.9?1.64，各组互相比较B＞C＞D＞A。小鼠肺组织内GATA3主要表达于气道上皮细胞、气道周围及肺组织、肺间质中的淋巴细胞和巨噬细胞等炎性细胞的细胞胞浆和细胞核中，A组小鼠炎性细胞较少，GATA3表达不明显。B组小鼠肺组织炎性细胞多于A组，GATA3表达强度高于A组小鼠，表达范围大于A组小鼠(p＜0.05)，C组小鼠炎性细胞少于B组小鼠，肺组织中GATA3表达强度低于B组小鼠，其表达范围也少于B组小鼠(p＜0.05)。D组小鼠肺组织中GATA3表达强度低于C组，其表达范围也少于C组。(p＜0.05)。 （4）ELISA法测定小鼠BALF结果 IL-13测定结果（单位pg/ml）：A组：最大值99.2、上四分位数84、中位数79.4、均值78.4、下四分位数66.2、最小值65.2、标准差13.2；B组：最大值364.6、上四分位数362.2、中位数355.2、平均值335.3、下四分位数290.8、最小值284.9；标准差52.9；C组：最大值213.9、上四分位数210.4、中位数192.8、平均值195.2、下四分位数180、最小值177.7、标准差22.5；D组最大值173.4、上四分位数161.7、中位数142.6、平均值139.1、下四分位数116.9、最小值108.7、标准差16.7，各组互相比较结果：B组＞C组＞D组＞A组(p＜0.05)。 IL-5测定结果（单位pg/ml）：A组：最大值184.3、上四分位数172.8、中位数165.8、平均值164.8、下四分位数162.4、最小值101.4、标准差7.7；B组：最大值360.7、上四分位数306.6、平均值274.4、中位数264.1、下四分位数231.8、最小值219.2、标准差55.4；C组：最大值262.1、上四分位数226.3、平均数190.2、中位数189.5、下四分位数174.6、最小值145.8、标准差38.3：D组最大值164.5、上四分位数157.6、中位数146.1、平均值146.1、下四分位数136.9、最小值125.4、标准差15.3，各组互相比较结果：B组＞C组＞A组＞D组(p＜0.05)。 结论：鼠尾注射过继经母牛分支杆菌免疫的脾脏γδT细胞可以抑制小鼠哮喘模型形成。其机制可能与上调T-bet、下调GATA-3表达而调节T-bet/GATA-3平衡，从而升高Th1免疫活动水平，纠正哮喘引起Th1/Th2失衡，缓解气道炎症，降低气道反应性有关。 收起