摘要: 肝细胞癌（HCC）是常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率居高不下。多数患者确诊时即为中晚期，可选治疗措施很少，预后非常差。免疫检查点抑制剂等新型免疫疗法的出现给HCC患者带来了新希望。免疫治疗主要是通过诱导和扩增肿瘤特异性T细胞，尤其是CD8... 展开 肝细胞癌（HCC）是常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率居高不下。多数患者确诊时即为中晚期，可选治疗措施很少，预后非常差。免疫检查点抑制剂等新型免疫疗法的出现给HCC患者带来了新希望。免疫治疗主要是通过诱导和扩增肿瘤特异性T细胞，尤其是CD8+T细胞，增强其反应活性或者阻止其功能耗竭和凋亡等，从而增强特异性杀瘤效应。强劲的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞反应可抑制HCC的复发，与患者无进展生存期甚至总生存期呈正相关。因此，肿瘤抗原特异性T细胞反应活性的动态监测能即时直接地观察免疫疗法的效果并有利于指导后续治疗方案和判断疾病的预后转归。 然而，目前HCC相关肿瘤抗原的T细胞表位谱的研究仍然很不完善，被鉴定报道的T细胞表位数量极少，如CD8+T细胞表位中，AFP只有22个，hTERT有16个，GPC3有11个，其他则更少，而且主要被少数几种HLA-A分子所提呈（HLA-A0201、A2402或A1101），无法覆盖特定地区人群的HLA分子多态性，更没有符合中国人群HLA多态性的T细胞表位谱，因此极大限制了对HCC患者开展肿瘤抗原特异性T细胞的普适性检测，严重阻碍了临床医师对免疫治疗效果的即时和直接评价，也阻碍了传统治疗预后与复发的早期预判。深入分析HCC相关肿瘤抗原的T细胞表位谱具有重要意义，将能为肿瘤抗原特异性T细胞功能的监测、基于T细胞免疫的免疫疗法发展和HCC-机体免疫互作机制研究等提供分子基础和靶标。 研究目的： 中国人群中基因频率大于1%的优势HLA-A分子有13种，总基因频率达95%以上。HCC相关的肿瘤抗原种类很多，其中AFP、GPC3和GP73在患者群中的阳性表达率分别为50%-80%、65%-80%和63%-72%。本项目拟明确AFP、GPC3和GP73三种抗原中被13种中国人群优势HLA-A分子提呈的优势T细胞表位谱；组建广谱T细胞表位肽库，与ELISPOT技术结合，建立HCC患者特异性T细胞反应活性的普适性检测系统；制备混合多肽疫苗，探讨其在HLA-A转基因鼠体内诱导HCC肿瘤抗原特异性CD8+T细胞反应的能力和抗肿瘤效应。 研究方法： 1、T细胞表位的预测和候选表位肽的筛选：通过Uniprot数据库确定AFP、GPC3和GP73三种肿瘤抗原的氨基酸序列；利用多种T细胞表位预测数据库，分别预测三种抗原被13种优势HLA-A分子限制的CD8+T细胞表位肽，选择符合至少两种预测算法标准的表位肽作为候选表位肽，合成并进行一系列实验验证。 2、候选表位肽的免疫原性验证：将HCC患者PBMCs与候选表位肽共培养，利用IFN-γELISPOT实验验证候选表位肽的免疫原性。能刺激PBMCs中记忆性T细胞活化分泌IFN-γ的候选表位肽称为阳性表位肽，说明具有免疫原性；进一步利用HLA-A等位基因相匹配的HCC患者PBMCs与各阳性表位肽共孵育7天，通过IFN-γ胞内染色和流式细胞分析实验检测阳性表位肽刺激记忆CD8+T细胞活化的能力；用HLA-A等位基因相匹配的健康者PBMCs诱导7天培养DC，将阳性表位肽与DC和自身PBL共培养14天（DC-肽-PBL共刺激实验），检测阳性表位肽刺激初始CD8+T细胞活化的能力。 3、阳性表位肽的HLA交叉限制性分析：利用表达特定HLA-A分子的HMy2.CIR细胞株和荧光标记的参考肽，与阳性表位肽进行多肽与HLA分子竞争结合实验，分析各阳性表位肽与相关HLA-A分子的交叉结合能力（即HLA交叉限制性）；利用T2细胞株与HLA-A0201分子限制的阳性表位肽进行亲和力实验，进一步验证相关阳性表位肽与HLA-A0201分子的结合能力。 4、特异性T细胞反应活性的检测：将由系列HLA-A分子提呈的阳性表位肽组成多个抗原肽池，建立IFN-γELISPOT检测系统，分别检测HCC患者和健康者PBMCs中HCC相关肿瘤抗原特异性T细胞的反应活性。 5、混合多肽疫苗诱导特异性CD8+T细胞反应：将来自AFP、GPC3和GP73的被HLA-A0201分子提呈的阳性表位肽与佐剂poly(I:C)混合，制成混合多肽疫苗，三次皮下接种HLA-A0201/DR1转基因小鼠，用IFN-γELISPOT法和胞内细胞因子染色法检测免疫后小鼠脾细胞群中表位肽特异性CD8+T细胞的频率；7-AAD染色法检测免疫后小鼠脾细胞在体外对HepG2的特异性杀伤能力；流式检测免疫后小鼠脾细胞群中各T细胞亚群的比例及PD-1表达水平；Hamp;E染色评估免疫后小鼠各脏器的病理变化。 6、混合多肽疫苗的抗肿瘤实验：利用HepG2肝细胞癌细胞株建立NSG鼠移植瘤模型，过继输注混合多肽疫苗接种后的HLA-A2/DR1转基因鼠脾细胞，并联合PD-1单抗治疗，同时设立poly(I:C)免疫后脾细胞过继治疗联合PD-1和单独免疫后脾细胞过继治疗对照组；观察移植瘤的生长曲线；免疫组化检测CD8+T细胞的肿瘤浸润程度；分离肿瘤浸润淋巴细胞，在96孔板与混合多肽共培养20h，利用ELISA法定量检测培养上清中IFN-γ的浓度。 研究结果： 1、根据Uniprot数据库确定了AFP、GPC3和GP73三种肿瘤抗原的氨基酸序列；共筛选出被13种优势HLA-A分子限制的93种候选CD8+T细胞表位肽，其中AFP、GPC3和GP73分别有30种、31种和32种。 2、将HCC患者PBMCs与候选表位肽共刺激培养，通过IFN-γELISPOT实验共验证出35种候选表位肽具有免疫原性：10种、12种和13种表位分别来自AFP、GPC3和GP73；用HLA-A等位基因相匹配的HCC患者PBMCs与各阳性表位肽共刺激培养7天和胞内IFN-γ染色，明确了23种所测试的阳性表位肽均能诱导患者PBMCs中特异性CD8+T细胞活化；用HLA-A等位基因相匹配的健康者PBMCs诱导DC，通过DC-肽-PBL共刺激培养14天和胞内IFN-γ染色，明确了30种所测试的阳性表位肽均能诱导健康者PBL中特异性CD8+T细胞活化。 3、通过T2细胞株的亲和力实验和转染HLA-A分子的CIR细胞株的多肽竞争结合实验，初步明确了35种阳性表位肽与相关HLA-A分子的交叉结合能力，即HLA交叉限制性。 4、将来自AFP、GPC3和GP73的112种表位肽组成广谱抗原肽池，建立IFN-γELISPOT检测系统，分别检测58例HCC患者和11例健康者PBMCs中抗原特异性T细胞的反应活性。HCC患者群的平均斑点数显著多于健康者群；产生AFP特异性T细胞反应的病人数最多，且AFP特异性T细胞反应强度较GPC3和GP73强。 5、将被HLA-A0201分子提呈的14种阳性表位肽与poly(I:C)混合，制备混合多肽疫苗免疫HLA-A2/DR1小鼠。IFN-γELISPOT和细胞内IFN-γ染色显示：混合多肽疫苗在小鼠体内诱导了强劲的表位肽特异性CD8+T细胞反应，SFUs数量和IFN-γ+/CD8+T 细胞频率分别是对照免疫组的5.6-11倍和3.9-29.7倍；细胞杀伤实验显示，混合多肽疫苗免疫后小鼠脾细胞在体外对HepG2呈特异性杀伤效应，而对空载的T2细胞株和负载无关多肽的T2细胞株无明显杀伤作用；流式分析显示，混合多肽疫苗免疫后小鼠脾细胞群中CD8+T细胞亚群以及CD8+/CD4+T细胞比例显著升高，而且CD8+T细胞表面的PD-1表达水平也高于对照免疫组；Hamp;E染色显示多肽免疫后小鼠各脏器未见明显病理损伤。 6、对NSG荷瘤鼠过继输注混合多肽疫苗免疫后HLA-A2/DR1转基因鼠的脾细胞，并联合PD-1单抗治疗，获得最小的肿瘤体积，治疗效果最佳；联合治疗组肿瘤组织中有更多的CD8+T细胞浸润，且浸润淋巴细胞在体外与混合肽共培养后，上清中分泌的IFN-γ水平也最高。 研究结论： 本研究成功鉴定了被中国人群优势HLA-A分子提呈的35种新的肝细胞癌相关肿瘤抗原的CD8+T细胞表位，扩大了中国人群HCC相关抗原的T细胞表位谱；初步验证了利用广谱表位肽池检测患者中HCC抗原特异性T细胞的可能性；制备了HCC相关抗原的T细胞表位混合多肽疫苗，肯定了其在HLA转基因鼠体内诱导特异性CD8+T细胞反应的能力和抗肿瘤效应。 收起