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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 目的:宫颈癌(cervical cancer)是最常见的女性生殖系统肿瘤,具有高的发病率和死亡率。研究表明宫颈癌的发生和发展是多种基因参与、多个步骤完成的复杂疾病过程。尽管细胞学和/或HPV筛查成为预防宫颈癌的有效措施,但是其发生的不可预测性和隐蔽性仍... 展开 目的:宫颈癌(cervical cancer)是最常见的女性生殖系统肿瘤,具有高的发病率和死亡率。研究表明宫颈癌的发生和发展是多种基因参与、多个步骤完成的复杂疾病过程。尽管细胞学和/或HPV筛查成为预防宫颈癌的有效措施,但是其发生的不可预测性和隐蔽性仍然是宫颈癌患者诊治时面临的重要难题。近年来,大量的研究表明环状RNA(circRNA)与多种人类疾病的发生发展密切相关,在几种人类癌症中充当必需的调节剂。科学证据清楚地表明宫颈癌是由人乳头瘤病毒(HPV)某些基因型的持续感染引起的。而炎性细胞因子TNF-α诱导的NF-κB活化是炎症导致癌症的常见机制。因此,我们通过深度测序的方法检测了TNF-α处理后HeLa细胞中表达变化的circRNA,并从中挑选了上调最明显的circSND1作为研究对象。本文意在探究circSND1对宫颈癌细胞恶性行为的影响及其潜在的分子机制,从而阐明circSND1在宫颈癌发生发展中的作用,这或许可以为宫颈癌的前期诊断和治疗提供新的思路。 方法:首先,通过高通量测序的方法检测了TNF-α处理后人宫颈癌HeLa细胞中circRNA的表达差异性。随后运用RT-qPCR方法对测序结果中表达上调的11种circRNA进行验证,并从中筛选出上调最为明显的circSND1作为后续研究对象。然后通过RNaseR耐受性实验验证circSND1是否耐受RNaseR消化;通过核质RNA分离实验研究circSND1在宫颈癌细胞中的定位;通过MTT实验、Transwell迁移和侵袭实验、平板克隆形成实验以及westernblot实验研究了circSND1对宫颈癌细胞恶性行为的影响。为了进一步探究circSND1的具体作用机制,我们首先应用RegRNA2.0生物信息学软件预测了circSND1上可能存在的miRNA结合位点,并通过RT-qPCR、westernblot实验进行验证。而后通过一系列宫颈癌细胞表型实验探究了miR-125a-3p在宫颈癌细胞中发挥的作用。接下来,通过TargetScan和miRBase生物信息学软件预测了miR-125a-3p潜在的靶mRNA,并通过RT-qPCR、westernblot实验进行验证,而后通过一系列宫颈癌细胞表型实验研究了FUT6在宫颈癌细胞中发挥的作用。最后,应用RT-qPCR、westernblot实验验证了circSND1对FUT6的调控作用是否依赖并通过miR-125a-3p实现的,并通过一系列挽救实验验证circSND1对宫颈癌细胞的功能学作用是否也同样是由miR-125a-3p介导的。 结果:高通量测序结果显示了TNF-α处理后HeLa细胞中circRNA的表达差异性。RT-qPCR实验结果进一步证实了测序结果中表达上调的circRNA,其中circSND1升高最为明显。RNaseR耐受性实验证实了circSND1对RNaseR的耐受性。核质RNA分离实验结果表明circSND1在宫颈癌细胞的细胞核和细胞质中均存在,且主要定位于细胞核中。细胞功能学实验结果显示,circSND1能够促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力,并加速上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)进程,不影响细胞增殖能力。这表明circSND1在宫颈癌的发生发展过程中扮演着促癌基因的角色。随后我们应用RegRNA2.0生物信息学软件预测了circSND1上潜在的miRNA结合位点,通过RT-qPCR和EGFP报告质粒的westernblot实验最终选定了miR-125a-3p。细胞功能学实验显示,miR-125a-3p能够降低宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力,并减缓上皮间转化进程。这表明miR-125a-3p作为一种抑癌基因在宫颈癌的发生发展过程中发挥作用。接下来通过RT-qPCR和westernblot实验最终选定了FUT6作为miR-125a-3p的靶mRNA,随后的一系列宫颈癌细胞表型实验结果表明FUT6能够促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力并加速上皮间质转化进程。我们通过RT-qPCR以及westernblot实验进一步证实了circSND1对FUT6的调控作用是通过miR-125a-3p实现的。同时,挽救实验结果证实circSND1对宫颈癌细胞的促癌作用也是通过miR-125a-3p介导的。 结论:研究结果表明TNF-α诱导的circSND1通过miR-125a-3p/FUT6途径促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力。 收起
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