摘要: 目的： 1.通过对既往相关病例进行回顾性研究分析，评估牵张成骨(DO)技术在临床中对大段骨缺损(MBD)的治疗效果及优缺点。 2.构建SD大鼠胫骨DO模型，探究DO模型中H血管的表达及骨碎补总黄酮(TFRD)的干预作用。 3.分别构建EPCs和BMSCs细胞牵张... 展开 目的： 1.通过对既往相关病例进行回顾性研究分析，评估牵张成骨(DO)技术在临床中对大段骨缺损(MBD)的治疗效果及优缺点。 2.构建SD大鼠胫骨DO模型，探究DO模型中H血管的表达及骨碎补总黄酮(TFRD)的干预作用。 3.分别构建EPCs和BMSCs细胞牵张应力培育系统，探讨骨碎补总黄酮对EPCs增殖、迁移、血管形成及对BMSCs成骨分化的作用效果。 方法： 1.DO技术临床病例回顾性研究 回顾分析广州中医药大学第一附属医院骨一科2013年1月～2019年9月采用DO技术治疗大段骨缺损的病例，共10例。通过观察骨愈合指数与骨与功能分级评分等指标来评估DO技术治疗大段骨缺损的临床疗效。 2.动物实验研究 (1)SD大鼠胫骨DO模型的构建 18只12周龄的SPF级SD雄性大鼠用于构建DO模型，分别在DO静歇期末、牵张期末和固化期末三个时间点行X线检测、HE、Masson和SafraninO染色实验以评估动物模型构建质量。 (2)SD大鼠胫骨DO模型中H血管表达及TFRD的干预作用 构建4-mm骨缺损(bone defect, BD)模型作为对照，DO模型与BD模型根据是否应用TFRD再分为中药和对照两个亚组，即60只SD大鼠按照随机数字表法随机分为4组：DO对照组(CON)、DO中药组(TFRD)和BD对照组(CON)、BD中药组(TFRD)，每组15只。 ①取SD大鼠健侧胫骨，4%多聚甲醛固定后，行脱钙、脱水、包埋、切片等处理，免疫荧光检测干骺端、骨内膜处、骨干不同区域内H血管表达情况； ②在术后第27天(牵张期末)、41天(固化中期)和55天(固化期末)行X线检测评估各组骨缺损间隙内骨修复情况； ③在固化期末行Micro-CT检测，评估各组骨缺损重建效果； ④在牵张期末行血管造影实验，观察各组骨缺损内血管生成情况； ⑤在术后第27天(牵张期末)和55天(固化期末)获取SD大鼠术侧胫骨，4%多聚甲醛固定后，行脱钙、脱水、包埋、切片等处理，免疫荧光双标实验分别检测各组骨缺损间隙内H血管表达变化情况； ⑥取⑤中白片分别行HE、Masson和SafraninO染色实验观察骨组织形态学和血管生成情况； ⑦取⑤中白片行免疫组化染色观察成血管、成骨相关因子表达情况。 (3)骨碎补总黄酮通过PDGF-BB/PDGFR-β信号通路调控H血管生成促进牵张成骨中成血管-成骨耦联作用 60只SD大鼠构建DO模型，按照随机数字表法随机分为中药组(TFRD)、PDGF-BB中和抗体组(PDGF-BB-Ab)、中药+PDGF-BB中和抗体组(TFRD+PDGF-BB-Ab)和对照组(CON)，每组15只。 ①在固化期末获取SD大鼠术侧胫骨，4%多聚甲醛固定后，行脱钙、脱水、包埋、切片等处理，免疫荧光法检测各组牵张间隙内H血管表达情况； ②在固化期末分别行Micro-CT和血管造影检测观察牵张区域内新骨生成和血管生成情况； ③取①中白片行HE、Masson和SafraninO染色实验观察组织形态学结果； ④获取牵张间隙内新鲜组织，行Western-blot检测各组新生组织中PDGF-BB、VEGF、RUNX2和OSX的蛋白表达情况； ⑤获取牵张间隙内新鲜组织，行RT-qPCR检测各组新生组织中PDGF-BB、VEGF、RUNX2和OSX的mRNA表达情况。 3.细胞实验研究 (1)TFRD有效成分及浓度测定 通过液质联用方法定量测定TFRD中有效成分及其浓度。 (2)TFRD对牵张应力环境下EPCs增殖、迁移及血管生成的作用 3周龄SD大鼠股骨和胫骨髓腔提取原代EPCs，培养、传代。应用STREX细胞牵张应力加载系统构建细胞牵张体系；CCK-8法检测不同浓度TFRD在1、3、5、7和14天的增殖情况；选取最佳TFRD浓度干预牵张应力下的EPCs，Transwell小室和体外血管形成实验分别检测TFRD对EPCs迁移和血管形成能力的影响。 (3)TFRD对牵张应力环境下BMSCs成骨分化的作用 3周龄SD大鼠股骨和胫骨髓腔提取原代BMSCs，培养、传代。应用STREX细胞牵张应力加载系统构建细胞牵张体系；从实验(2)中获取来自EPCs的条件培养基(CM)用于培养BMSCs，ALP和ARS染色实验检测不同CM对BMSCs成骨分化的影响，继而观察牵张应力环境下TFRD对BMSCs成骨分化的作用。 结果： 1.DO技术临床病例回顾性研究 经随访10例患者中1例脱落，剩余9例获得骨性愈合，骨缺损平均长度为10.30±3.98cm，平均愈合所需时长为343.67±133.33天，平均愈合指数为1.441±0.062月/cm，2例出现针道感染；术后肢体功能评级中5例为优，3例为良，1例为一般。 2.动物实验研究 (1)SD大鼠胫骨DO模型的构建 应用环形外固定架固定在位，未见松动、移位迹象，且牵张过程中截骨端对位对线良好，未见成角畸形，模型构建成功率约为88.9%。 (2)SD大鼠胫骨DO模型中H血管表达及TFRD的干预作用 ①SD大鼠胫骨内H血管的鉴定 SD大鼠胫骨内检测出H血管表达，且H血管空间分布存在差异性，胫骨干骺端和骨内膜处表达较为丰富，形态较好，而在骨干区分布较少，且形态各异不规则。 ②各组H血管表达变化 术后第27天，与BD模型相比，DO模型骨缺损间隙内H血管的表达高于BD模型组(P＜0.05)，而在同一模型中，TFRD组比对照组H血管表达更高，TFRD组中H血管数要多于对照组(P＜0.05)；在术后第55天，H血管在各组中的表达趋势相似于术后第27天，即DO模型比BD模型中有更多的H血管生成(P＜0.05)，DO模型中TFRD组比对照组生成更多的H血管，但值得注意的是，BD模型中TFRD组与对照组无明显差异。此外，相比于术后第27天，第55天各组H血管的表达均有所减弱，H血管数量均有所减少。 ③DO模型中H血管与血管生成、骨生成的关系 X线、Micro-CT结果显示，DO模型较BD模型有更多的骨痂生成，且更早出现骨愈合，血管造影结果表明DO模型较BD模型有更多的血管生成；而在DO或BD同一模型中，与对照组相比，TFRD组有更多的新骨和血管生成；DO模型的Lane-Sandhu评分、BV/TV值和新生血管体积值均大于BD模型(P＜0.05)，且在同一模型中TFRD组的Lane-Sandhu评分、BV/TV值和新生血管体积值明显大于对照组(P＜0.05)。HE、Masson和SafraninO染色结果进一步证实了X线、Micro-CT和血管造影的结果。免疫组化结果显示，与BD模型相比，DO模型中CD31、VEGF、RUNX2和OSX的表达均明显升高；在DO或BD同一模型中，TFRD组中CD31、VEGF、RUNX2和OSX的表达均高于对照组。 (3)骨碎补总黄酮通过PDGF-BB/PDGFR-β信号通路调控H血管生成促进牵张成骨中成血管-成骨耦联作用 ①各组固化期末牵张区域内H血管表达 免疫荧光结果显示，与CON组相比，TFRD组和TFRD+PDGF-BB-Ab组牵张区域内H血管的表达均更强，但PDGF-BB-Ab组牵张区域内H血管的表达却较弱，TFRD组中H血管表达最强，PDGF-BB-Ab组中H血管表达最弱。 ②各组固化期末骨修复重建结果 Miro-CT结果表明，与CON组相比，TFRD组牵张间隙内可见更多的新骨生成，骨折线消失，且新骨基本塑形完全，骨髓腔已再通；而TFRD+PDGF-BB-Ab组相比于CON组亦可见更多新骨生成，骨折线较CON组稍模糊；但PDGF-BB-Ab组较CON组新骨生成明显减少，骨折线清晰可见。TFRD组与TFRD+PDGF-BB-Ab组的BV/TV值显著高于CON组(P＜0.05)，但PDGF-BB-Ab组的BV/TV值低于CON组(P＜0.05)。 ③各组固化期末血管新生结果 血管造影结果显示，与CON组相比，TFRD组牵张间隙内可见更多的血管生成，而TFRD+PDGF-BB-Ab组较中CON组亦可见更多的血管生成，但PDGF-BB-Ab组中新生血管较CON组明显减少；新生血管体积定量分析表明TFRD组和TFRD+PDGF-BB-Ab组新生血管体积明显多于CON组(P＜0.05)，而PDGF-BB-Ab组新生血管体积少于CON组(P＜0.05)。 ④各组组织形态学结果 HE、Masson和SafraninO染色结果显示，TFRD组牵张区域内有大量新骨生成，且已基本桥接缺损两端，骨髓腔已再通；TFRD+PDGF-BB-Ab组有较多骨样基质形成，矿化趋势明显，可见部分骨样结构；而PDGF-BB-Ab组牵张间隙内组织成分复杂，可见大量纤维软组织嵌入；CON组牵张间隙内生成大量软骨基质，但相较于TFRD+PDGF-BB-Ab组成熟度不高，未出现明显的骨性结构。 ⑤各组成血管、成骨相关因子蛋白、mRNA表达结果 TFRD组和TFRD+PDGF-BB-Ab组牵张区域内新生组织中PDGF-BB、VEGF、RUNX2、OSX的蛋白表达、mRNA的表达均高于CON组(P＜0.05)，但PDGF-BB-Ab组各因子的蛋白表达、mRNA表达却低于CON组(P＜0.05)。 3.细胞实验研究 (1)骨碎补总黄酮有效成分及浓度测定 有效成分包含柚皮苷和新北美圣草苷，浓度分别为173.082ng/mL和131.833ng/mL。 (2)骨碎补总黄酮对牵张应力环境下EPCs增殖、迁移及血管生成的作用 CCK-8实验结果表明TFRD对EPCs最佳的作用浓度为100ug/mL；牵张应力(strained )环境下EPCs迁移的数目数要多于非牵张应力环境(unstrained )((P＜0.05)，而在相同应力条件下，相比于CON组，TFRD组EPCs迁移的数目更多(P＜0.05)；牵张应力(strained)环境下EPCs形成的管型总长度要大于非牵张应力(unstrained)环境下EPCs形成的管型总长度(P＜0.05)，且在相同应力条件下，相比于CON组，TFRD组中EPCs形成的管型总长度更大(P＜0.05)。 (3)骨碎补总黄酮对牵张应力环境下BMSCs成骨分化的作用 ALP和ARS染色实验表明，在牵张应力(strained)环境下各组ALP与ARS阳性染色的结果明显优于非牵张应力(unstrained)环境下的染色结果。在牵张应力(strained)环境下，CM1组ALP与ARS染色最深，阳性染色面积百分比值(PA/TA)显著大于其余四组(P＜0.05)，CM2和CM3两组间PA/TA值虽无明显差异，但相比于CON组，两组PA/TA值更大(P＜0.05)，而CM4组PA/TA值比CON组有所增大，但无统计学差异。 结论： 1.DO技术临床病例回顾性研究 采用DO技术治疗大段骨缺损骨临床效果满意，但存在新骨钙化缓慢、治疗周期过长等问题。 2.动物实验研究 (1)应用环形外固定架构建的SD大鼠胫骨DO模型质量可靠，成功率高。 (2)H血管存在于SD大鼠胫骨DO模型之中，相比于单纯的骨愈合过程，牵张应力可促进H血管生成，TFRD可协同牵张应力进一步促进H血管生成；DO模型中H血管表达的高低与DO过程中血管生成和骨生成效果强弱表现协同一致性，而TFRD可明显 收起