摘要: 目的： 1．在细胞水平探讨牡荆素对iMADs增殖及成骨分化的作用； 2．在细胞水平探讨牡荆素联合BMP9对iMADs成骨分化的协同作用； 3．在动物水平进行皮下成骨注射，探讨牡荆素联合BMP9在体内对皮下成骨的作用。 方法: 1．细胞实验研究 ... 展开 目的： 1．在细胞水平探讨牡荆素对iMADs增殖及成骨分化的作用； 2．在细胞水平探讨牡荆素联合BMP9对iMADs成骨分化的协同作用； 3．在动物水平进行皮下成骨注射，探讨牡荆素联合BMP9在体内对皮下成骨的作用。 方法: 1．细胞实验研究 (1)牡荆素对iMADs增殖、成骨分化的作用 iMADs进行复苏、传代、培养。CCK8检测不同浓度的牡荆素在不同的时间点对iMADs增殖情况的影响；设置空白对照组，成骨诱导组和成骨诱导加牡荆素组(2、5、10uM )，对iMADs进行成骨分化诱导，诱导后7天进行碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性定量及染色检测分析牡荆素刺激下的早期成骨能力，诱导14天进行茜素红染色检测钙结节形成情况分析对晚期矿化的影响；qPCR分析牡荆素对成骨分化相关基因表达的影响。 (2)牡荆素联合BMP9对iMADs成骨分化的作用 用Ad-GFP、Ad-BMP9感染HEK293细胞，反复扩增几次得到高滴度的Ad-GFP、Ad-BMP9用于后续实验。实验分为三组，分别为GFP组、BMP9组和牡荆素+BMP9组。细胞种板干预后7天进行ALP活性定量及染色检测分析各种条件干预下iMADs的早期成骨能力；第10天油红O染色检测脂肪形成情况；诱导14天进行茜素红染色检测钙结节形成情况分析对晚期矿化的影响；qPCR检测不同干预条件下成骨分化标志物Runx2、ALP、OSX、OPN及成脂分化基因PPARγ等表达水平的变化。 2.动物实验研究 用Ad-Gluc感染iMADs，感染24h后收集细胞并用温敏性大分子聚合物混合明胶(PPCN-G)的支架材料混合，滴种于提前预冷的12孔板中，37°培养箱中孵育30min后加入2ml培养基，在不同时间点检测Gluc活性观察iMADs在细胞支架材料PPCN-G中的生存情况。将20只6周龄无胸腺雌性裸鼠随机分成4组，每组5只，GFP组、牡荆素组，BMP9组和牡荆素+BMP9组，分别用腺病毒Ad-GFP、Ad-BMP9和Polybrene一起感染细胞，干预24h后收集各组细胞并用40ulPPCN-G重悬，同时加入目标浓度的牡荆素，将细胞接种于裸鼠背部，建立裸鼠体内异位骨化模型，监测各组裸鼠皮下异位包块的生长情况，注射6周后处死裸鼠，取出皮下包块固定后行microCT扫描并进行三维重建，计算骨体积。皮下包快进行脱钙、脱水、包埋、切片处理，苏木精-伊红(HE染色)及Masson’sTrichrome染色评估包块内骨组织形态学变化。 结果： 1．细胞实验研究 (1)牡荆素对iMADs增殖、成骨分化的作用 ①CCK8测定牡荆素对iMADs活力的影响。结果显示，当在2-10μM之间的浓度下使用牡荆素干预iMADs1、3、5d后，加药组的细胞生长正常，没有观察到牡荆素的细胞毒性作用及对细胞的生长抑制。 ②ALP活性测定：对iMADs进行成骨分化诱导7d后，与空白对照组相比，成骨诱导组的ALP活性明显升高(P＜0.05)；在一定浓度范围内，成骨诱导加牡荆素组的ALP活性较单纯成骨诱导组的活性升高(P＜0.05)，ALP活性在10μM时最高。 ③ALP染色：对iMADs进行成骨分化诱导7d后，空白对照组未见蓝色深染物形成，成骨诱导组和成骨诱导加牡荆素组均可见ALP阳性的蓝染物，当牡荆素浓度为10μM时，颜色最深。 ④茜素红染色：成骨诱导14天后，空白对照组未见明显钙结节形成，成骨诱导组和牡荆素加成骨诱导组部分细胞均可见红色钙结节形成，当牡荆素浓度为10μM时，骨矿化最明显，红色钙结节形成的数量最多。 ⑤成骨分化相关基因的表达：在成骨诱导第7天检测不通过浓度牡荆素干预下成骨相关基因的表达的变化。qPCR结果显示，牡荆素以剂量依赖性的方式显著上调ALP、OPN、Runx2和OSX的表达。因此，10μM的浓度被作为最佳剂量用于后续实验室的研究。 (2)牡荆素联合BMP9对iMADs成骨分化的作用 ①ALP活性测定：ALP的活性随着成骨分化的过程会呈现先上升再下降的趋势；在不同的时间点，BMP9组的ALP活性明显高于GFP组(P＜0.05)，牡荆素联合BMP9组的活性则高于BMP9组(P＜0.05)。 ②ALP染色:结果表明BMP9+牡荆素组的蓝紫色染液颜色最深，较BMP9组表现出更强的阳性，GFP组则几乎观察不到蓝染组织。ALP染色结果与ALP活性测定结果趋势一致。 ③茜素红染色：成骨分化诱导14d后，BMP9组和BMP9+牡荆素组均可见大量钙结节产生，表明BMP9能够诱导细胞的成骨分化；在10uM牡荆素作用下，钙盐的沉积得到了增强，表明牡荆素能够促进BMP9诱导的成骨分化的效应。 ④油红O染色及成骨、成脂分化相关基因的表达：BMP9进行成骨分化诱导10d后进行油红O染色发现BMP9处理后的细胞有较多的油红O阳性细胞数量，牡荆素加入后减少了细胞内油红O阳性的细胞。与GFP组相比，BMP9能显著上调成骨基因ALP、OPN、Runx2、OSX的表达；当加入牡荆素后，成骨分化相关基因在BMP9+牡荆素组显示出更高的表达水平。此外，BMP9能够显著促进成脂分化相关基因PPARγ的表达，牡荆素则有效地抑制了BMP9组PPARγ的表达。 2.动物实验部分 通过细胞在PPCN-G支架中3D培养及进行Gluc活性测定，结果表明PPCN-G支架具有良好的粘附性，牡荆素能够促进细胞在支架内的分化；microCT结果表明牡荆素联合BMP9组能够形成较大的包块，定量分析发现牡荆素联合BMP9组的骨量更多。HE及Masson染色结果表明BMP9组和牡荆素+BMP9均能诱导生成许多成熟的骨小梁和骨基质，但牡荆素明显增强了这种效应。 结论： 1细胞部分 牡荆素可单独促进iMADs细胞在体外的成骨分化，并且能够增强成骨相关基因的表达。在BMP9诱导的成骨效应中，牡荆素起到了协同作用，不仅加强了成骨表型的改变，还提高了成骨基因的表达变化，同时抑制了成脂基因的表达。 2动物实验部分 牡荆素在体外PPCN-G支架中能够促进iMADs细胞的增殖。在体内能够增强BMP9诱导形成的异位骨的大小，增厚骨小梁及骨的矿化，具有良好的骨诱导效应。 收起