摘要: 目的：流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，严重危害人类健康，接种流感疫苗仍是现阶段预防流感最有效的措施。现用流感疫苗多为灭活疫苗，其副反应多且免疫原性差，为提高疫苗的安全性及免疫原性，本研究选择DDA阳离子脂质作为疫苗佐剂，构建D... 展开 目的：流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，严重危害人类健康，接种流感疫苗仍是现阶段预防流感最有效的措施。现用流感疫苗多为灭活疫苗，其副反应多且免疫原性差，为提高疫苗的安全性及免疫原性，本研究选择DDA阳离子脂质作为疫苗佐剂，构建DDA复合物脂质体流感疫苗，以期通过鼻黏膜免疫获得较高的免疫效力，从而有效预防流感，为新型疫苗及其佐剂的开发提供有价值的参考。 方法：1以DDA阳离子脂质作为脂质膜的主要成分，以中性磷脂DSPC作为辅助脂质，TPGS及PEG作为免疫调节剂，通过薄膜分散法制备DDA-DSPC、DDA-DSPC-TPGS和DDA-DSPC-PEG脂质体并包载流感抗原，考察粒径、Zeta电位、包封率(EE)、载药量(LE)等重要指标，对所制备的各脂质体流感疫苗进行特性评价。并通过筛选冻干保护剂及冻干条件，对脂质体流感疫苗的冻干处方及工艺进行初步探索。 2体外培养小鼠骨髓树突状细胞（BMDCs），通过细胞毒性试验考察DDA阳离子脂质体复合物对树突细胞的毒性，通过流式细胞仪（Flow Cytometer，FCM）考察未成熟BMDCs对包载荧光标记蛋白的不同脂质体的摄取情况，评价不同脂质体与抗原提呈细胞（APCs）相互作用并呈递抗原的能力。并以MHCII、CD80、CD86为指标，考察各组脂质体流感疫苗刺激DC2.4细胞分化成熟的能力。 3以C57BL/6小鼠为动物模型，通过鼻黏膜免疫，采用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测小鼠黏液分泌型IgA（sIgA）、血清IgG1及小鼠脾脏细胞因子IFN-γ、IL-4的表达水平，对DDA复合物脂质体流感疫苗的免疫效应进行初步评价。 结果：1采用薄膜分散法制备的脂质体流感疫苗，分散介质为pH7.4的Tris-buffer，所得DDA-DSPC脂质体流感疫苗粒径685.0±17.8nm，PDI0.522±0.342，zeta电位25.4±1.9mV，EE65.7±2.0%，LE6.2±0.2%；DDA-DSPC-TPGS脂质体流感疫苗粒径337.3±2.4nm，PDI0.555±0.061，zeta电位15.4±2.1mV，EE78.5±1.5%，LE4.2±0.2%；DDA-DSPC-PEG脂质体流感疫苗的粒径591.4±19.3nm，PDI0.470±0.023，zeta电位6.9±0.8mV，EE45.8±3.0%，LE3.0±0.3%。透射电镜观察，以上各组脂质体疫苗外观均呈圆球形或椭球形。此外，通过对脂质体疫苗进行冻干处方及工艺的考察，优化得到脂质体疫苗冻干的最佳处方为5%的蔗糖和5%的乳糖按质量比1:1合用，冻干条件为预冻温度-80℃，预冻时间8h，在此条件下脂质体疫苗冻干效果比较良好。 2体外摄取实验结果显示未成熟的BMDCs和DC2.4与包载FITC-BSA的各组脂质体孵育2小时后，DDA-DSPC脂质体组摄取率最高，与其他各组相比，有极显著性差异（p＜0.01）。游离抗原FITC-BSA组摄取率最低，其他两组DDA-DSPC-TPGS和DDA-DSPC-PEG组摄取率低于DDA-DSPC组，但与抗原组相比，均有一定程度的提高。DCs细胞成熟实验结果显示，各组DDA复合物脂质体均能显著上调DCs表面共刺激分子CD86及MHC-II的表达水平（p＜0.05），表明DDA复合物脂质体能够促进DCs的分化成熟。 3DDA-DSPC组脂质体流感疫苗经鼻黏膜免疫后，可显著提高鼻黏液中IgA抗体滴度，DDA-DSPC-TPGS组脂质体流感疫苗可显著提高血清IgG1及小鼠脾脏细胞因子IFN-γ的表达水平（p＜0.05），但各组脂质体流感疫苗均未有效诱导IL-4的表达。 结论：采用薄膜分散法制备了包封率较高的DDA复合物脂质体流感疫苗，外观呈圆球形或椭球形，并对其冻干处方及工艺进行了初步考察。体外摄取实验结果显示，DDA复合物脂质体能够提高DCs对其的摄取，尤其是DDA-DSPC组，其摄取效果明显高于其他两组。DCs成熟实验结果显示，和抗原组相比，DDA复合物脂质体能够上调DCs表面共刺激分子CD80、CD86及MHC-II的表达水平，表明DDA复合物脂质体能够刺激诱导DCs分化成熟。动物实验结果显示，三组DDA复合物脂质体流感疫苗经鼻黏膜免疫后，能够诱导较高水平的血清IgG1抗体、鼻黏液IgA抗体及IFN-γ，体现了DDA复合物脂质体良好的佐剂特性，尤其是DDA-DSPC-TPGS组脂质体流感疫苗，其诱导的小鼠血清IgG1及脾细胞分泌上清中IFN-γ的表达水平高于其他各组，表明TPGS具有一定的免疫调节作用。 收起