摘要: 慢性鼻窦炎(Ⅱ、Ⅲ型)鼻腔鼻窦手术后常须进行长期的随访治疗，以防术腔鼻黏膜瘢痕粘连及炎症复发。严重的黏膜病变还可能伴有免疫功能异常，如变应性鼻炎、哮喘、囊性纤维化、先天性纤毛不动综合征等。如何使病变或受损的鼻腔黏膜重新发挥正常功能是... 展开 慢性鼻窦炎(Ⅱ、Ⅲ型)鼻腔鼻窦手术后常须进行长期的随访治疗，以防术腔鼻黏膜瘢痕粘连及炎症复发。严重的黏膜病变还可能伴有免疫功能异常，如变应性鼻炎、哮喘、囊性纤维化、先天性纤毛不动综合征等。如何使病变或受损的鼻腔黏膜重新发挥正常功能是国内外鼻科学者关注的问题。近来研究表明小鼠胚胎干细胞和成人骨髓间充质干细胞可以分化成为纤毛细胞。但前者涉及伦理学，无法在人体进行研究，后者分化较差。脐带血含有丰富的造血干细胞/祖细胞(HSCs)和间充质干细胞(MSCs)，取材方便，来源广泛；受到胎盘屏障保护，其成分被病毒、细菌污染概率低；脐带血免疫系统较为原始，降低了移植后受体的排异反应；脐带血中含有丰富的干细胞，更为原始并具有有更强的分化能力；不涉及社会、法律及伦理方面的争议；脐带血不仅可以作为异体基因移植的供体，而且还可以低温保存数十年。因此，以脐血间充质干细胞作为组织修复材料具有广阔的前景。为了探索脐血间充质干细胞是否能向鼻黏膜上皮分化，进行了以下研究。 第一部分，体外脐血间充质干细胞培养体系的建立。 目的：探讨脐血MSCs的分离、培养、纯化和扩增的方法及规律，研究其生物学特性，进一步探讨体外诱导脐血MSCs向纤毛上皮定向分化的可行性和诱导条件，为研究脐血MSCs作为种子细胞来治疗鼻科疾病提供理论依据和实验基础。 方法：取孕34～40周产妇自然分娩或剖宫产胎儿的脐血20～80mL，分别采用羟乙基淀粉分离法和淋巴细胞分离液法分离单个核细胞。将DMEM/F12+10％胎牛血清加入离心管中，吹打制成单细胞悬液。以适当密度接种于胎牛血清(FBS)包被的6孔板中，置于37℃、饱和湿度，体积分数为5％CO2孵箱中培养。7d首次全量换液，去掉未贴壁的悬浮细胞，以后每5天换液1次。待细胞长到80％汇合时，以1：1的0.25％胰酶/0.02EDTA混合液消化传代，每日在倒置相差显微镜下观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征。流式细胞仪鉴定P3代细胞表面标志CD44、CD13、CD45、CD34，并取第3代细胞测定细胞周期。 结果：采用淋巴细胞分离液和羟乙基淀粉分离法均成功分离出MSCs。原代培养于2-4周时细胞可达80％汇合，此时可以传代。传至第3代时细胞形态较均一，折光性好。经流式细胞仪检测结果显示，P3代脐血间充质干细胞稳定地高表达CD13、CD44等表面抗原标记物，阳性率分别为86.18％、90.30％，弱表达CD34、CD45等造血细胞标志，表明MSCs是存在于脐带血中区别于造血细胞的一群非定向干/祖细胞，这与骨髓MSCs的表面抗原标志相一致。第3代脐血单个核细胞周期分析显示95.29％的细胞处在G0/G1期。18份脐血，都分离出不同量的单核细胞，只有3份孕34-37周和1份孕38周的的胎儿脐血得到足量可以传代的梭形细胞，占22％。 结论：早产胎儿脐血更易得到可以传代和纯化的干细胞，可能与其脐血中间充质干细胞量更多有关。但是足月胎儿脐血也可以获得一定数量纯化和具有增殖分化能力的干细胞。目前各种优化条件还在研究中，尚缺乏统一有效的方法。 第二部分，鼻黏膜上皮细胞的培养和鉴定。 目的：建立分离细胞培养方案和气液界面培养法培养人鼻黏膜上皮细胞的培养体系。了解不同培养方法对纤毛上皮的影响。 方法：取全身麻醉下鼾症手术切取的健康下鼻甲黏膜，用含抗(氟康唑、庆大霉素)PBS溶液，在超净台中反复冲洗、浸泡，用0.1％胶原酶Ⅳ消化，分别接种到T25培养瓶进行鼻黏膜上皮分离细胞培养法培养；接种到鼠尾胶原Ⅰ型包被Transwell支持膜的六孔培养板进行气液界面培养。在倒置相差显微镜下观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，行HE染色和PAS染色、免疫荧光染色、电镜及染色体检查。 结果：两种方法均成功培养了目的细胞。其中分离细胞培养法得到的细胞形态学上有典型卵石样排列，并夹杂有杯状细胞，抗人角蛋白CK-14阳性，说明其是上皮来源。抗β—Tubulin抗体与抗FOXJ1抗体均为阳性。扫描电镜和投射电镜均显示表面含有纤毛，但缺乏极性。P5代染色体检查正常，说明传代细胞可以保证染色体稳定，并进行相关试验。ALL法利用Transwell小室使细胞在模拟在体条件下生长，有助于表面纤毛的分化和颗粒的分泌，并且在形态学和免疫标志方面都得到证实。 结论：鼻黏膜细胞分离法可以得到纯度较高的鼻黏膜纤毛上皮细胞。ALL法不仅创造了与正常组织相似的微环境，而且应用鼠尾胶原蛋白Ⅰ型和适合气道上皮培养的支气管上皮培养基，是更适合纤毛分化的培养方法。 第三部分，脐血间充质干细胞分化为鼻黏膜纤毛上皮的研究。 目的：探讨人脐带血间充质干细胞在气液界面培养，并用鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包被支持膜和支气管上皮专用培养基培养的条件下，诱导分化成纤毛细胞的可能性。 方法：用rAAv2-EGFP转染人脐带血间充质干细胞，用鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包被支持膜，使用支气管上皮细胞专用培养基，建立气液界面培养。分别于1周和2周后收集细胞，行RT-PCR法检测MUC8基因的表达。UCB-MSCs在膜上细胞生长2周后进行抗β—Tubulin抗体和FOXJ1免疫荧光染色。 结果：转染2小时后可见细胞发出绿色荧光。48小时消化后上流式细胞仪检测，阳性率达97.9％。RT-PCR结果显示，UCB-MSCs不表达MUC8mRNA，鼻黏膜上皮强表达。随诱导培养时间延长，1周时MUC8mRNA弱表达，培养2周后较前增强，2周时未检测到抗β—Tubulin抗体的阳性表达，而FOXJ1于转染的绿色荧光蛋白背景下可观测到红色荧光阳性表达。在共聚焦显微镜的组合像中可以看到，部分标记绿色荧光的MSCs核内可见红色FOXJ1阳性荧光表达。 结论：UCB-MSCs在气液界面培养，鼠尾胶原蛋白Ⅰ型包被支持膜，支气管上皮细胞无血清培养基培养，是体外分离、培养和扩增的脐带血间充质干细胞诱导成为表达鼻黏膜纤毛上皮标记的细胞的适宜分化条件。 收起