摘要: 目的： 根尖乳头干细胞（stem cells from apical papilla，SCAP）是存在于年轻恒牙根尖乳头中的细胞，具有高度增殖和多向分化的潜能。体外研究表明，经诱导后，SCAP可分化为成牙本质样细胞并生成牙本质，较牙髓干细胞具有更强的增殖能力和分化潜... 展开 目的： 根尖乳头干细胞（stem cells from apical papilla，SCAP）是存在于年轻恒牙根尖乳头中的细胞，具有高度增殖和多向分化的潜能。体外研究表明，经诱导后，SCAP可分化为成牙本质样细胞并生成牙本质，较牙髓干细胞具有更强的增殖能力和分化潜能，是组织工程优良的种子细胞来源。microRNA(miRNA)是一类内源性非编码的小RNA，其数量仅占整个基因组的1％，却能够调控人类30％以上基因的表达，在细胞发育、分化、迁移、凋亡等方面均发挥着至关重要作用。miRNA主要通过对靶基因的降解或抑制其翻译来调控靶基因的表达。临床上，牙髓及根尖周疾病的治疗一直依赖于根管治疗技术，随着近年来再生医学与组织工程的发展以及miRNA研究的不断深入，miRNA在牙本质再生方面的作用逐渐得到探索。 本课题通过构建SCAP成骨诱导前后miRNA的表达谱，应用miRNA芯片及实时荧光定量PCR技术，筛选出差异表达的miR-629-3p，旨在明确miR-629-3p在SCAP成骨及成牙本质向分化中的作用及相关分子机制，从而为牙本质再生的研究提供理论依据，并优化miRNA介导的干细胞组织再生的治疗方法。 方法: 1.用酶消化法分离培养人根尖乳头干细胞(SCAP)，通过流式细胞术对细胞表面的标记物进行检测，成骨及成脂诱导后对细胞的多向分化能力进行检测。 2.分别提取“正常培养组”及“成骨诱导7天组”细胞中的总RNA，送测序公司进行高通量测序，通过生物信息学方法分析表达有差异的miRNAs，Real-timePCR验证芯片结果，最终筛选出差异表达明显的miR-629-3p。采用瞬时转染的方法增强和抑制miR-629-3p的表达，检测SCAP成骨及成牙本质向分化的能力。 3.利用生信数据库预测出miR-629-3p可能的靶基因，分析预测结果并结合文献分析确定出可能的靶基因，进一步行基因及蛋白水平检测。构建靶基因的野生型和突变型质粒，通过双荧光素酶报告基因实验验证其结合位点。小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）干扰靶基因的表达，对SCAP的成骨及成牙本质向分化能力进行检测。 结果: 1.成功分离培养SCAP，间充质干细胞表面标记物呈阳性表达，造血干细胞表面标记物呈阴性表达，提示分离培养的细胞为间充质来源。细胞成骨诱导培养后有许多矿化结节形成，成脂诱导后可见有脂滴形成。 2.芯片结果表明成骨诱导前后共有64个miRNA出现表达差异，有25个上调表达，39个下调。利用Real-time-PCR验证芯片结果，筛选出在成骨分化中下调表达的miR-629-3p进一步研究。增强miR-629-3p的表达后，SCAP的成骨及成牙本质向分化能力明显抑制。相反，抑制miR-629-3p的表达，其成骨及成牙本质向分化能力显著增强。 3.将软件预测结果和基因、蛋白水平的验证结果相结合，确定MAPK14为靶基因。通过双荧光素酶报告基因实验证实，miR-629-3p能够与MAPK14的3'UTR有效结合。抑制MAPK14的表达后，SCAP的成骨及成牙本质向分化能力明显降低。 结论: 1.miR-629-3p能够抑制SCAP的成骨及成牙本质向分化。 2.miR-629-3p在成骨向分化的过程中表达下调。 3.MAPK14为miR-629-3p的直接靶基因。抑制MAPK14的表达，SCAP的成骨及成牙本质向分化能力明显降低。 4.miR-629-3p可以通过靶标MAPK14抑制SCAP的成骨及成牙本质向分化。 收起