摘要: 目的： 铁是细菌生长和代谢的必需营养物质，胞内铁含量升高有利于细菌的繁殖。本研究在发现沙门菌质粒毒力基因spvB与细胞铁代谢密切相关的基础上，进一步探讨其分子机制。第一部分通过建立鼠伤寒沙门菌野生株 SL1344、突变株SL1344-ΔspvB和回补株... 展开 目的： 铁是细菌生长和代谢的必需营养物质，胞内铁含量升高有利于细菌的繁殖。本研究在发现沙门菌质粒毒力基因spvB与细胞铁代谢密切相关的基础上，进一步探讨其分子机制。第一部分通过建立鼠伤寒沙门菌野生株 SL1344、突变株SL1344-ΔspvB和回补株SL1344-c-spvB感染的小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠胚胎成纤维细胞MEF模型，分析spvB影响细胞铁代谢的机制，为阐明spvB促进宿主菌胞内繁殖提供新思路。第二部分应用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，构建敲除核转录因子Nrf2基因的小鼠巨噬细胞系，为探索NRF2在spvB影响细胞铁代谢中的作用提供研究工具和手段；应用该细胞系建立感染模型，分析 NRF2/FPN 途径在spvB影响细胞铁代谢从而促进宿主菌胞内繁殖中的作用，为深入研究spvB致病机制和防治沙门菌感染提供理论和实验依据。 方法： 第一部分 沙门菌质粒毒力基因 spvB 通过影响细胞铁代谢促进宿主菌胞内繁殖的机制研究 1. 细胞铁代谢在沙门菌质粒毒力基因spvB促进宿主菌胞内繁殖中的作用 鼠伤寒沙门菌野生株SL1344、突变株SL1344-ΔspvB和回补株SL1344-c-spvB按感染复数（multiplicity of infection，MOI）10:1与RAW264.7细胞共培养，建立细胞感染模型。感染后2h、4h和8h，平板菌落计数法检测胞内活菌计数，分析spvB对宿主菌胞内繁殖的影响；感染后2 h、4 h和8 h，比色法检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放量，分析spvB对细胞损伤的影响；用柠檬酸铁铵、硫酸亚铁和去铁酮预处理细胞30 min后，按上述方法建立细胞感染模型，感染4 h后平板菌落计数法检测胞内活菌计数，分析细胞铁代谢在spvB促进宿主菌胞内繁殖中的作用。 2. 沙门菌质粒毒力基因spvB影响细胞铁代谢的机制 上述三株受试菌分别按MOI 10:1和5:1与RAW264.7细胞和MEF细胞共培养，建立细胞感染模型。感染后2 h、4 h和8 h，qPCR和Western Blot检测铁摄取相关蛋白——转铁蛋白受体（transferrin receptor 1，TFRC）和二价金属离子转运蛋白1 （divalent metal transporter 1，DMT1）以及铁释放唯一蛋白——膜铁转运蛋白（ferroportin，FPN）表达水平，分析spvB对细胞铁代谢相关蛋白的影响。 3. 沙门菌质粒毒力基因spvB影响FPN的机制 上述细胞感染模型中加入转录抑制剂放线菌素D，感染2 h后qPCR检测Fpn表达水平，分析spvB是否在转录水平影响FPN表达；感染后2 h、4 h和8 h，qPCR和Western Blot检测调控Fpn转录的核转录因子——核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2，NRF2）、缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）和金属调节转录因子1（metal-regulatory transcription factor 1，MTF1）表达水平，分析spvB影响FPN的机制。 第二部分 沙门菌质粒毒力基因 spvB 通过 NRF2/FPN 途径影响细胞铁代谢的机制研究 1. Nrf2基因敲除小鼠巨噬细胞系的构建 应用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 Nrf2 基因敲除 RAW264.7 细胞。针对Nrf2基因设计一对GC%不同的sgRNA，以pUC57质粒为模板进行PCR扩增后连接至T载体，获得sgRNA重组载体；sgRNA重组载体与pGL3质粒经酶切、纯化回收、连接、转化和鉴定，获得 pGL3-sgRNA 重组质粒；应用电转化系统将pGL3-sgRNA重组质粒和Cas9质粒导入RAW264.7细胞，经筛选单克隆和鉴定后获得Nrf2基因敲除RAW264.7细胞。 2. NRF2/FPN途径在沙门菌质粒毒力基因spvB影响细胞铁代谢中的作用 上述三株受试菌按MOI 10:1分别与RAW264.7细胞和Nrf2-/- RAW264.7细胞共培养，建立细胞感染模型。感染2 h后qPCR检测Fpn表达水平，分析NRF2在spvB影响FPN转录中的作用。将上述三株受试菌按MOI 10:1与RAW264.7细胞共培养，建立细胞感染模型。感染4 h后免疫荧光观察NRF2与胞核共定位，比较不同感染组胞核 NRF2 表达差异；感染 4 h 后分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白， Western Blot检测胞浆和胞核NRF2表达水平，分析spvB抑制FPN转录的机制。 3. 沙门菌质粒毒力基因spvB不同结构域对NRF2的影响 为进一步明确spvB不同结构域对NRF2的影响，将上述三株受试菌、敲除spvB羧基端的突变株 SL1344-spvB ΔC-terminal 和敲除 spvB 氨基端的突变株SL1344-spvBΔN-terminal分别按MOI 10:1与RAW264.7细胞共培养，建立细胞感染模型。感染2 h后Western Blot检测NRF2表达水平，分析spvB不同结构域在spvB影响细胞铁代谢中的作用。 结果： 第一部分 沙门菌质粒毒力基因 spvB 通过影响细胞铁代谢促进宿主菌胞内繁殖的机制研究 1. 细胞铁代谢在spvB促进宿主菌胞内繁殖中的作用 SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组胞内活菌计数显著高于SL1344-ΔspvB感染组，表明spvB促进宿主菌的胞内繁殖；SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组LDH释放量显著高于SL1344-ΔspvB感染组，表明spvB可加重细胞损伤；用柠檬酸铁铵、硫酸亚铁和去铁酮处理后，SL1344 感染组和SL1344-c-spvB 感染组胞内活菌计数与 SL1344-ΔspvB 感染组无统计学差异，表明细胞铁代谢在 spvB 促进宿主菌的胞内繁殖中起重要作用。 2. 沙门菌质粒毒力基因spvB影响细胞铁代谢的机制 qPCR结果显示，SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组在感染早期Tfrc和Dmt1表达水平与SL1344-ΔspvB感染组无统计学差异，提示spvB影响细胞铁代谢可能与细胞铁摄取的生物学过程不相关；但SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组在感染早期Fpn表达水平显著低于SL1344-ΔspvB感染组，且Western blot检测FPN的结果与qPCR结果一致，提示spvB可能通过抑制FPN表达阻止细胞铁释放致胞内铁含量升高。 3. 沙门菌质粒毒力基因spvB影响FPN的机制 经放线菌素D处理后，SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组Fpn转录水平与SL1344-ΔspvB感染组无统计学差异，提示spvB在转录水平调控FPN表达；qPCR结果显示，未发现SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组Hif-1α和Mtf1表达水平低于SL1344-ΔspvB感染组，提示spvB抑制FPN表达可能与HIF-1α和MTF1不相关；但SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组Nrf2表达水平在感染早期显著低于SL1344-ΔspvB感染组，且Western blot检测NRF2的结果与qPCR结果一致，提示spvB通过抑制NRF2从而下调FPN转录水平。 第二部分 沙门菌质粒毒力基因 spvB 通过 NRF2/FPN 途径影响细胞铁代谢的机制研究 1. Nrf2基因敲除小鼠巨噬细胞系的构建 菌落PCR鉴定结果显示已成功构建sgRNA重组载体；酶切鉴定和DNA测序鉴定结果显示已成功构建pGL3-sgRNA重组质粒；Western blot鉴定结果显示已成功构建Nrf2基因敲除小鼠巨噬细胞系。 2. NRF2/FPN途径在沙门菌质粒毒力基因spvB影响细胞铁代谢中的作用 qPCR 结果显示， Nrf2-/- RAW264.7 细胞感染模型中 SL1344 感染组和SL1344-c-spvB感染组Fpn表达水平与SL1344-ΔspvB感染组无统计学差异，表明spvB通过NRF2/FPN途径影响细胞铁代谢；免疫荧光结果显示，SL1344感染组和SL1344-c-spvB 感染组胞核中 NRF2 表达水平显著低于 SL1344-ΔspvB 感染组；Western blot结果显示，SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组胞浆和胞核中NRF2表达水平均显著低于SL1344-ΔspvB感染组，该结果与免疫荧光结果一致，提示spvB通过阻止NRF2进入胞核从而抑制Fpn转录。 3. 沙门菌质粒毒力基因spvB不同结构域对NRF2的影响 Western blot结果显示，SL1344-spvB ΔN-terminal感染组NRF2表达水平低于SL1344-ΔspvB感染组，且与SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组无统计学差异；而SL1344-spvBΔC-terminal感染组NRF2表达水平与SL1344-ΔspvB感染组无统计学差异，且高于SL1344感染组和SL1344-c-spvB感染组，提示spvB抑制NRF2激活主要由其羧基端结构域介导。 结论： 1. 沙门菌质粒毒力基因spvB通过影响细胞铁代谢，在促进宿主菌的胞内繁殖中发挥重要作用。 2. 沙门菌质粒毒力基因spvB通过阻止NRF2进入胞核，抑制FPN表达从而限制胞内铁外排，导致铁含量升高有利于宿主菌的繁殖。 3. 沙门菌质粒毒力基因spvB抑制NRF2激活主要由其羧基端结构域介导。 收起