摘要: 铁死亡(Ferroptosis)是非凋亡型细胞死亡，其特征为铁依赖性的脂质过氧化物在胞内大量堆积。但迄今为止，对于铁死亡过程中铁异常积累的机制尚不清楚。细胞内铁稳态依赖于多种铁代谢相关蛋白，其中膜铁转运蛋白(Ferroportin，FPN)及淀粉样前体蛋白(Am... 展开 铁死亡(Ferroptosis)是非凋亡型细胞死亡，其特征为铁依赖性的脂质过氧化物在胞内大量堆积。但迄今为止，对于铁死亡过程中铁异常积累的机制尚不清楚。细胞内铁稳态依赖于多种铁代谢相关蛋白，其中膜铁转运蛋白(Ferroportin，FPN)及淀粉样前体蛋白(Amyloidprecursorprotein，APP)在胞内铁输出过程中发挥了重要的作用。FPN是已知的唯一负责细胞铁输出的跨膜铁转运蛋白，其功能的维持需要APP在胞浆合成后依靠轴突运输转位至胞膜，通过稳定FPN的表达介导细胞内铁输出。研究表明微管相关蛋白tau参与了细胞中APP的轴突转运，且课题组前期研究发现在细胞铁死亡过程中，tau蛋白出现降解异常，但细胞铁死亡过程中tau蛋白异常与胞内铁代谢紊乱之间的关系尚不明确。因此，本研究拟以小鼠脑神经瘤细胞(N2acell)为研究对象，通过铁死亡诱导剂Erastin处理建立细胞铁死亡模型，在此基础上探讨tau蛋白结构和功能的变化对APP轴突运输和胞内铁代谢的影响，以期阐明铁死亡信号通路中铁异常积累的机制。 方法:用铁死亡诱导剂Erastin（10μM）处理N2a细胞6hr，以诱导细胞发生铁死亡。在添加了Erastin（10μM）的基础上补充铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（2μM）共处理细胞6hr，以探索其逆转作用。药物处理过程选用2‰DMSO作为正常对照。药物处理后通过钙黄绿素荧光反向淬灭法、DCF法、免疫印迹、免疫沉淀、免疫荧光双标等技术检测相关分子生化指标的变化。 结果:(1)与对照组相比，Erastin单独处理使细胞中二价铁含量上调91.68％，细胞中总谷胱甘肽(glutamylcysteinylglycine，GSH)含量下调24.72％;与Erastin组相比，用Erastin和Ferrostatin-1共同处理细胞时，细胞中二价铁含量下调44.18％，GSH含量上调22.06％。(2)Erastin处理使细胞中活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)含量上调40.47％，细胞活性降低40％，当Erastin和Ferrostatin-1共同处理细胞时，以上细胞损伤均有所逆转。(3)通过检测胞内铁输出情况，发现Erastin显著抑制了胞内铁输出过程(p＜0.05)。同时，免疫印迹技术检测铁输出相关蛋白的表达水平，发现Erastin使细胞膜中FPN及APP蛋白含量均明显下调(p＜0.01);Ferrostatin-1处理可显著逆转细胞膜中FPN和APP表达量的降低(p＜0.05)。(4)免疫荧光双标结果显示，在对照组细胞中，FPN和APP在细胞中呈弥散样分布，经DAPI复染细胞核后将照片叠加可见FPN与APP呈现明显的共定位;Erastin处理使FPN与APP结合异常，荧光共定位信号强度明显减弱，Ferrostatin-1可有效逆转细胞中FPN与APP结合抑制。(5)免疫荧光结果显示，Erastin处理后细胞微管密度变稀疏，细胞骨架破坏。(6)tau蛋白生物学功能检测结果提示，Erastin明显下调细胞中与微管结合的tau蛋白含量(p＜0.01)，而Erastin和Ferrostatin-1共处理使与微管结合的tau蛋白含量明显上调(p＜0.05)。(7)免疫印迹结果显示，用Erastin处理细胞时，总tau蛋白含量、tau-Thr205和tau-Ser396位点磷酸化水平明显增加(p＜0.05)。免疫沉淀结果显示，用Erastin处理细胞时，胞内泛素化tau蛋白水平显著上调(p＜0.01)，且Ferrostatin-1可有效抑制细胞中总tau蛋白含量及tau蛋白磷酸化和泛素化修饰水平的变化。(8)Erastin处理诱导细胞中GSK-3β-Ser9位点磷酸化水平显著升高(p＜0.001)，表明GSK-3β活性上调;此外，用Erastin处理可显著下调细胞中UCH-L1的表达水平(p＜0.01)，Ferrostatin-1可有效逆转上述蛋白含量及活性的改变。 结论:上述结果表明，铁死亡诱导剂Erastin处理N2a细胞，引起胞内二价铁和ROS含量上调，总GSH含量下调，细胞活性降低，进而诱导细胞发生铁死亡。在细胞铁死亡发生过程中，胞内GSK-3β的活性升高及UCH-L1的表达水平的降低诱导tau蛋白发生异常磷酸化和泛素化修饰，tau蛋白翻译后修饰异常导致其与微管结合能力下降。tau蛋白生物学功能异常引起细胞骨架破坏进而诱导APP向细胞膜的转运异常，使得胞膜上APP及FPN的表达水平降低，从而抑制细胞铁输出并引起胞内铁离子积累。本研究从铁输出角度探讨了细胞铁死亡过程中tau蛋白功能异常对APP介导的铁输出过程的影响，为进一步明确细胞铁死亡信号通路中铁离子积累的机制提供了较好的实验依据。 收起