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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 目的: 本实验旨在探究Tyro3、Axl受体及其配体Gas6、ProS对炎症反应的作用及其机制,以及CS-CNT靶向递药系统的制备。 方法: 1.构建Tyro3-pEGFP-N1和Axl-pEGFP-N1质粒。GenBank中查找小鼠Tyro3和Axl基因的mRNA序列,由公司设计引物序列,R... 展开 目的: 本实验旨在探究Tyro3、Axl受体及其配体Gas6、ProS对炎症反应的作用及其机制,以及CS-CNT靶向递药系统的制备。 方法: 1.构建Tyro3-pEGFP-N1和Axl-pEGFP-N1质粒。GenBank中查找小鼠Tyro3和Axl基因的mRNA序列,由公司设计引物序列,RT-PCR扩增Tyro3和Axl基因的全长片段,酶切,与空质粒pEGFP-N1连接。鉴定方法采用测序和双酶切。 2.CS-CNT的制备。将购买的CNT用浓硝酸和浓硫酸的混合液纯化、氧化,再与CS反应合成CS-CNT。 3.实验分组: ①实验组1:Tyro3、Tyro3+Lps、Tyro3+Gas6+Lps、Tyro3+ProS+Lps、Tyro3+Gas6+ProS+Lps ②实验组2:Axl、Axl+Lps、Axl+Gas6+Lps、Axl+ProS+Lps、Axl+Gas6+ProS+Lps ③空质粒组:pEGFP-N1、pEGFP-N1+Lps、pEGFP-N1+Gas6+Lps、pEGFP-N1+ProS+Lps、pEGFP-N1+Gas6+ProS+Lps ④单独配体组:BC、Lps、Gas6+Lps、ProS+Lps、Gas6+ProS+Lps 4.ELISA法检测细胞上清IL-6,IL-10,IL-33,TNF-α及TLR4的含量。 5.通过Real Time Q-PCR方法检测各组细胞中IL-6,MYD88,TNF-α,TLR4 mRNA的表达。 6.Western blot法检测各组细胞中SOCS1、SOCS3、TLR4和NF-κB蛋白的表达。 7.扫描及透射电镜观测CNT的修饰情况。 8.递药系统CS-CNT复合物的制备。 结果: 1、Tyro3-pEGFP-N1和Axl-pEGFP-N1质粒构建 1.1.Tyro3-pEGFP-N1和Axl-pEGFP-N1质粒的构建与鉴定 成功构建Tyro3-pEGFP-N1和Axl-pEGFP-N1质粒,双酶切后琼脂糖凝胶电泳分别显示两条带,其分子量大小与预期大小相同。测序鉴定结果与Gen Bank中的小鼠Tyro3和Axl基因序列一致。 1.2.Tyro3-pEGFP-N1和Axl-pEGFP-N1质粒在RAW264.7小鼠巨噬细胞内表达 Tyro3-pEGFP-N1、Axl-pEGFP-N1和空质粒pEGFP-N1转入RAW264.7细胞24h后,荧光显微镜下可观测出绿色荧光,表明转染成功。 2、Tyro3、Axl对LPS诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞的作用: 2.1.ELISA法检测结果:加入配体Gsa6和ProS预处理30min,对Lps刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌的炎症因子IL-6,IL-33,TNF-α,TLR4具有明显的下调作用,并可促进抗炎因子IL-10的分泌。 2.2.Real Time Q-PCR方法检测结果:与实验各组对比,加入配体Gsa6和ProS预处理30min,可明显抑制IL-6、MYD88、TLR4和TNF-α的表达。 2.3.Western blot法检测结果:实验各组TLR4蛋白的表达在Lps刺激RAW264.7细胞后明显升高,但加入配体Gas6和ProS预处理,明显使TLR4和NF-κB的表达水平下降。同时,可促进SOCS1和SOCS3的表达。 3.CS-CNT的制备 通过实验及相关文献获取CS-CNT的最佳合成方法。 结论: Tyro3和Axl及其配体Gas6和ProS抑制Lps激活TLR4信号通路引发的炎症反应,TLR4的激活又抑制Gas6和ProS的表达,表明TLR4信号通路与Tyro3和Axl及其配体Gas6/ProS系统相互调节。 收起
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