摘要: 目的:研究S100A8基因特异性位点甲基化在人原发性肝细胞癌（HCC）中的表达情况，并在细胞水平、动物水平观察S100A8对HCC增殖、迁移、侵袭及裸鼠成瘤能力的影响，从而为进一步了解S100A8对HCC细胞生物学行为的影响并为探讨其作用机制、寻找HCC诊断及预... 展开 目的:研究S100A8基因特异性位点甲基化在人原发性肝细胞癌（HCC）中的表达情况，并在细胞水平、动物水平观察S100A8对HCC增殖、迁移、侵袭及裸鼠成瘤能力的影响，从而为进一步了解S100A8对HCC细胞生物学行为的影响并为探讨其作用机制、寻找HCC诊断及预后的新靶点奠定基础。 方法: 1.利用公共数据库Gene Expression Omnibus(GEO)及The CancerGenome Atlas，（TCGA，）进行检索，根据检索词及严格的数据纳入、排除标准，进行荟萃分析。 2.采用TCGA数据库中数据经过严格筛选后将其甲基化程度分组后进行生存分析（Kaplan-Meier法）。 3.收集临床样本，利用焦磷酸测序技术验证原发性肝细胞癌组织与其对应的癌旁组织中cg20070090位点的甲基化水平，并通过受试者工作特征曲线(ROCcurve)探索cg20070090位点在肝细胞癌诊断中的临床价值。 4.构建S100A8慢病毒表达载体，通过人胚源肾细胞293T及慢病毒包装系统合成病毒液，经过病毒浓缩和滴度检测，选取最适量病毒液侵染目的肝癌细胞Huh7、MHCC-97H（以下简写97H）和HepG2。 5.形成稳定细胞系后，通过Realtime-qPCR、蛋白质免疫印迹(WB)分别检测S100A8 mRNA与蛋白的表达。 6.细胞功能实验，体外探讨S100A8对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。 7.裸鼠皮下成瘤实验，在体内研究S100A8对肝癌细胞致病的影响。 结果: 1.课题组两名以上成员对公共数据库(GEO、TCGA)的甲基化芯片数据进行检索;严格按照纳入、排除标准选取符合的研究;最终有5个数据集被纳入本研究。荟萃分析结果提示，S100A8甲基化程度与HCC的发生率有关联（SMD=-2.08，95％CI:-2.54--1.62）。发表偏倚分析中P＞0.05，提示没有明显的发表偏倚，结论可信度较高。并经过敏感性分析剔除每个研究后，重复进行荟萃分析，结果并未发生改变，提示本次研究荟萃分析的结果具有高度稳定性。 2.TCGA数据库中数据经过严格筛选后，最终选取了345名肝癌患者数据进行生存分析(Kaplan-Meier);结果显示，在4组甲基化水平分组比较中，总生存期(OS)和无进展生存期（PFS）均有明显的差异。低甲基化组(Q1)的OS和PFS明显短于高甲基化组。 3.焦磷酸测序部分，配对t检验结果显示癌组织的平均甲基化水平为（32.93％±14.82％）;癌旁组织平均甲基化水平为(64.91％±4.65％);ROC曲线下面积(AUC)为0.950（P＜0.01），最佳截断值为54.025％，敏感度为86.53％，特异性为98.07％。结果表明此实验方法的结果准确性较高。 4.本研究成功包装合成了S100A8过表达及沉默的慢病毒液;经过慢病毒液的浓缩及滴度检测，筛选出合适量的病毒液，并用于侵染目的肝癌细胞株Huh7、MHCC-97H和HepG2;形成稳定细胞系，为下一步功能实验提供研究对象。 5.稳定细胞系Huh7-S100A8、MHCC-97H-S100A8经过抗生素稳定筛选成功，HepG2-S100A8筛选失败。Western blot及Real time-qPCR验证结果显示Huh7-S100A8、97H-S100A8蛋白及mRNA表达量均高于空载对照组（Control）。 6.在肝癌细胞中转染S100A8过表达载体后，Huh7-S100A8、MHCC-97H-S100A8增值能力均高于对应的Control组;迁移、侵袭能力也明显高于Control组;而流式细胞凋亡检测则无很明显的趋势。 7.裸鼠皮下成瘤实验部分，Huh7-S100A8、97H-S100A8组的鼠瘤体积、重量均大于Control组。 结论: 1.通过公共数据库荟萃分析显示S100A8特异性位点低甲基化水平与HCC发生呈正相关。偏倚分析、敏感性分析等提示本次研究荟萃分析的结果具有高度稳定性。 2.生存分析显示，低甲基化组的OS和PFS明显低于高甲基化组，结果具有统计学意义。 3.焦磷酸测序技术验证原发性肝细胞癌组织与其对应的癌旁组织中cg20070090位点的甲基化水平，显示癌组织的平均甲基化水(32.93％±14.82％)显著低于癌旁组织平均甲基化水平(64.91％±4.65％)。 4.成功构建了过表达S100A8基因的肝癌细胞系Huh7-S100A8、97H-S100A8。 5.利用稳定细胞系Huh7-S100A8、97H-S100A8初步分析了其生物学功能，S100A8的上调促进肝肿瘤细胞的增殖、转移与侵袭。 6.成功完成裸鼠皮下种瘤实验，认为S100A8的上调可促进裸鼠肝皮下瘤的生长。 收起