摘要: 肝细胞癌(HCC)是当前严重威胁我国人民生命健康的重大恶性肿瘤，而其复发转移是导致死亡率居高不下的最主要原因。究其发生的机制虽有大量研究，但目前仍未完全阐明。因此，深入研究HCC复发转移的分子机制并以此为基础探索防治复发转移的有效措施，对... 展开 肝细胞癌(HCC)是当前严重威胁我国人民生命健康的重大恶性肿瘤，而其复发转移是导致死亡率居高不下的最主要原因。究其发生的机制虽有大量研究，但目前仍未完全阐明。因此，深入研究HCC复发转移的分子机制并以此为基础探索防治复发转移的有效措施，对进一步提高HCC的总体治疗水平具有重要意义。 表皮生长因子样结构域7(Egfl7)是近年来新发现的一种分泌型蛋白，已有的研究证明其在胚胎血管发育的成管过程中发挥了重要作用。近来的研究发现Egfl7能够显著增强内皮细胞及成纤维细胞的运动迁移能力，提示Egfl7具有调控细胞运动迁移的生物学功能。更重要的是，Egfl7在胚胎组织中高水平表达，在成熟组织中几乎不表达，而在肿瘤等增殖性组织中呈高度上调，提示Egfl7可能在肿瘤发生、发展中发挥了重要作用。我们前期的研究也发现，Egfl7 mRNA在HCC组织中的表达水平明显上调并与HCC包膜形成密切相关，提示Egfl7可能参与HCC侵袭转移过程，但其作用机制目前尚不清楚。因此，本研究在进一步分析Egfl7在HCC中表达情况的基础上，通过慢病毒介导的小RNA干扰技术抑制Egfl7的表达，通过一系列体外、体内方法研究Egfl7调控HCC侵袭转移的分子机制，同时探讨阻断Egfl7表达对 HCC侵袭转移的影响。我们获得了以下研究结果： 1.我们采用半定量RT-PCR、荧光实时定量PCR和Westem blot等方法检测了Egfl7 mRNA和蛋白在31例新鲜HCC组织及相应邻近非瘤肝组织(ANLT)中的表达水平，结果发现Egfl7 mRNA和蛋白在HCC组织中均明显高表达，且Egfl7在孤立性大肝癌(SLHCC)中的表达明显低于结节性肝癌(NHCC)。免疫组化法检测112例HCC组织的结果显示Egfl7在90.2%(101/112)的HCC组织中表达，且其表达水平与HCC的肿瘤结节数目、有无静脉浸润及有无包膜形成等临床病理特征密切相关。Egfl7高表达组HCC患者的无瘤生存时间及总体生存时间均明显短于Egfl7低表达组的患者，且单因素与多因素Cox回归模型均显示Egfl7高表达是HCC预后的独立危险因素。同时，夹心ELISA法发现HCC病人血清中Egfl7水平相对于慢性肝病病人、胃肠道恶性肿瘤病人、肝良性肿瘤病人和正常人亦明显上升(详见颜鹏等其他研究生毕业论文)。这些结果提示Egfl7的高表达与HCC的侵袭转移密切相关，并可能因此而影响了HCC患者的预后。 2.双标间接组织免疫荧光法检测Egfl7在HCC组织中的分布情况，结果显示Egfl7绝大多数定位于HCC组织中的肿瘤细胞胞质内。Western blot方法检测Egfl7蛋白在HepG2、MHCC97-L及HCCLM3这三种侵袭转移能力依次升高的肝癌细胞系中的表达并以常氏肝细胞系CCL13作为对照，结果显示Egfl7蛋白在三种肝癌细胞系中的表达水平较之CCL13细胞系均明显升高，且以HCCLM3细胞系的表达水平最高，在MHCC97-L细胞系中的表达水平次之，HepG2最低，提示Egfl7的表达水平与与肝癌细胞的侵袭转移潜能密切相关。 3.我们构建了pLKO.1Egfl7RNAi+ siRNA质粒，并建立了稳定表达Egfl7 siRNA片断和对照片断的HCCLM3细胞(HCCLM3Egn7RNAj+和HCCLM3Egn7RNAi-)。Western blot结果发现HCCLM3 Egfl7RNAi+细胞中Egfl7蛋白的表达被明显抑制，干预效率超过70%。划痕实验和Transwell侵袭小室实验结果均显示HCCLM3Egfl7RNAi+细胞较HCCLM3 Egn7RNAi-细胞迁移运动能力明显下降；MTT法结果显示HCCLM3Egfl7RNAi+和HCCLM3Egn7RNAi-细胞的增殖能力无显著性差异(P>0.05)；Annexin V和PI双染法结合流式细胞仪检测结果显示HCCLM3Egfl7RNAi+与HCCLM3Egfl7RNAi-细胞的凋亡的差异无统计学差异(P>0.05)。且Bcl-xL和BAX在HCCLM3Egfl7RNAi+与HCCLM3Egfl7RNAi-细胞中的表达无明显差异性(P>0.05)。这些研究结果均提示：体外抑制Egfl7的表达可以显著抑制肝癌细胞的迁移运动，而不影响其增殖和凋亡。 4.已有研究发现Egfl7敲除的小鼠中，血管内皮细胞中局部粘着斑激酶(FAK)的磷酸化水平明显下降，同时血管内皮细胞的迁移能力明显减弱。我们因而推测，Egfl7可能通过促进FAK磷酸化激活从而调控肝癌细胞的迁移运动能力。因此，我们用Western blot法证明HCCLM3Egfl7RNAi+细胞中总FAK水平没有明显改变，但磷酸化FAK水平明显下降。当我们用全长重组Egfl7蛋白(50ng/ml)刺激HCCLM3Egfl7RNAi+细胞后，Western blot检测结果显示其磷酸化FAK水平明显上调；细胞免疫荧光结果显示其肌动蛋白(F-actin)细胞骨架发生明显的形变；划痕实验和Transwell侵袭小室实验证明其迁移运动能力明显增强。这些结果提示Egfl7可通过调控FAK磷酸化激活从而促进肝癌细胞的迁移运动。 5.鉴于Egfl7拥有两个表皮生长因子样结构域(EGF-likedomain)，我们推测其可能通过表皮生长因子受体(EGFR)介导FAK的磷酸化激活。因此，我们利用EGFR的特异性抑制剂(15μM)先行处理HCCLM3Egfl7RNAi+细胞，再施以Egfl7蛋白(50ng/ml)刺激，观察HCCLM3Egfl7RNAi+细胞中FAK磷酸化水平、细胞骨架及迁移运动能力的变化。结果显示，HCCLM3Egfl7RNAi+细胞中FAK磷酸化水平无明显变化，F-actin细胞骨架无明显形变，细胞迁移运动能力亦无明显增强，即EGFR抑制剂可阻断Egfl7蛋白刺激HCCLM3Egfl7RNAi+细胞所产生的后续效应，提示Egfl7通过EGFR介导FAK磷酸化而促进肝癌细胞迁移运动，证明Egfl7/ EGFR/FAK这一信号传导通路在肝癌细胞迁移运动的调控中发挥了重要作用。 6.为在体内观察抑制Egfl7对肝癌侵袭转移的影响，我们在HCCLM3转移性人肝癌细胞裸鼠模型的基础上，建立了裸鼠原位肝癌转移模型。免疫组化结果显示，siRNA抑制Egfl7表达后，裸鼠肝脏原位HCCLM3种植瘤中Egfl7及磷酸化FAK的表达水平明显下调；测量肝脏原位种植瘤的大小及周围结节数目，结果显示体内抑制Egfl7的表达能够抑制HCCLM3原发瘤的生长并减少其肝内转移；裸鼠肺组织连续切片计数肺转移的数目，结果显示体内抑制Egfl7能够抑制HCCLM3细胞的肺转移。我们的结果证明体内抑制Egfl7表达可抑制FAK磷酸化并显著抑制了HCC的生长和肝内外转移。 我们的上述研究结果首次证明Egfl7在HCC组织及病人血清中高表达，且其表达水平与HCC肿瘤结节数目、包膜形成及静脉浸润等临床病理特征密切相关，并显著影响了HCC患者的预后。同时，我们首次发现Egfl7主要表达于HCC组织中的肿瘤细胞，且Egfl7可通过EGFR介导FAK磷酸化促进肝癌细胞迁移运动，从而在HCC侵袭转移中发挥重要作用，抑制Egfl7表达可在体内外显著抑制肝癌细胞的侵袭转移。本研究首次揭示了Egfl7在HCC侵袭转移中的新的生物学作用并初步阐明其作用机制，提示Egfl7可作为HCC诊断、复发转移监测和预后评估的新型血清/分子标志物及HCC复发转移治疗的潜在干预靶点，有望为HCC的诊断及复发转移的防治提供新的理论依据和研究思路。 收起