摘要: 复杂的生理屏障、耐药性以及肝癌组织抑制性的微环境导致肝细胞癌成为恶性程度高、临床治疗难度大的恶性肿瘤。绝大多数患者在确诊时已属于疾病的中晚期，能通过根治手术获益的病人仅有10%-20%。免疫治疗，特别是基于甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein,AFP... 展开 复杂的生理屏障、耐药性以及肝癌组织抑制性的微环境导致肝细胞癌成为恶性程度高、临床治疗难度大的恶性肿瘤。绝大多数患者在确诊时已属于疾病的中晚期，能通过根治手术获益的病人仅有10%-20%。免疫治疗，特别是基于甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein,AFP）的免疫疗法在肝细胞癌治疗过程中显示出较大潜力，然而其临床效果依然有限。因此，亟需寻找一种新的治疗策略以提高AFP特异性的抗肿瘤免疫应答。树突状细胞（Dendriticcells,DC）是激发获得性免疫应答最重要的抗原提呈细胞，它可以刺激未致敏的初始T淋巴细胞引发初次免疫应答。而慢病毒在转染非分裂细胞(尤其是DC)方面优于逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒。最近，高迁移率族核小体结合域蛋白1（HighMobilityGroupNucleosomeBindingDomainProtein1,HMGN1）作为抗肿瘤免疫的增强分子，已被用作一种新型的免疫佐剂,其在胞外可活化DC，并诱导DC的趋化性募集。然而，HMGN1在增强肝细胞癌AFP特异性抗肿瘤免疫应答方面的潜力尚不清楚。因此，本课题在三种肝癌小鼠模型和人肝癌细胞系上对表达有融合蛋白HMGN1和AFP慢病毒疫苗的抑瘤效果进行了系统测试，深入评估了HMGN1在增强AFP特异性抗肿瘤免疫应答方面的应用潜力，并对慢病毒疫苗的体内分布及抗肿瘤机制进行了初步探索，以期为肝细胞癌的治疗提供一种新的思路和策略。 为进一步提高AFP特异性抗肿瘤免疫应答，我们构建了一种编码HMGN1和AFP融合蛋白的慢病毒疫苗（Lenti-HA）。WB检测结果显示：慢病毒可以在宿主细胞中高丰度地表达其携带的靶抗原，并且可以在胰岛素信号肽的引导下将融合蛋白分泌到细胞外发挥作用。通过流式细胞术和细胞毒实验证明：Lenti-HA可以显著提高小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的成熟度，并增强T淋巴细胞的活化能力，以起到更强的杀伤效果。并且在三种小鼠肝细胞癌模型上，包括皮下、原位和原发肝癌模型，系统测试了Lenti-HA的抗肿瘤效果及对免疫和肿瘤微环境的调控作用进行了检测。为验证这一新型疫苗在肝癌患者上应用的可行性，我们在人肝癌细胞系上对Lenti-HA的杀伤能力进行了测试。结果显示：在皮下、原位及原发肝细胞癌小鼠模型以及人肝癌细胞系上，Lenti-HA能够有效抑制肿瘤生长、延长荷瘤小鼠的生存期并且对人肿瘤细胞进行有效杀伤，说明Lenti-HA能够激活DC进而诱发抗原特异性免疫杀伤。尤为重要的是，Lenti-HA对原发肝癌小鼠的治疗，可以显著改善荷瘤小鼠抑制性的免疫和肿瘤微环境及有效抑制肝脏肿瘤向肺部转移。Lenti-HA能够有效提高AFP表达慢病毒疫苗（Lenti-AFP）的免疫原性。与Lenti-AFP相比，Lenti-HA免疫原性的提高可以显著降低慢病毒的使用剂量达6倍，从而显著提高慢病毒体内治疗的安全性。通过对慢病毒体内分布的检测发现，慢病毒主要分布于腹股沟淋巴结，并且未显示出明显的细胞倾向性。对其作用机制的初步解析发现Lenti-HA可能通过在腹股沟淋巴结招募和活化具有迁移活性的DC细胞尤其是CD103+DC，从而诱发AFP抗原特异性的抗肿瘤免疫应答。此外，我们发现在Lenti-HA治疗过程中CD8+T淋巴细胞起主导作用，并且记忆性T淋巴细胞和自然杀伤细胞也在Lenti-HA所介导的抗肿瘤免疫应答过程中起重要作用。 我们的研究表明：HMGN1是一种有效的抗肿瘤免疫佐剂，能够显著增强AFP介导的抗肿瘤免疫应答，在三种不同的肝细胞癌小鼠模型上，能够有效抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠的生存期。尤为重要的是，可以显著提高Lenti-AFP的免疫原性达6倍。并且在原发肝癌小鼠模型上，可以显著的改善免疫和肿瘤微环境。对其机制初探发现：CD8+T淋巴细胞在Lenti-HA治疗过程中起主要作用，但记忆T细胞及NK细胞也起重要作用。在人肝癌细胞系上也表现为AFP特异性抗肿瘤免疫应答反应的增强。本研究为肝细胞癌的免疫治疗提供了一种新型候选药物和治疗策略，可加速慢病毒疫苗的临床转化。 收起