摘要: 个体发育的影响因素不仅仅是由其基因型决定，同时还受到外界环境因素的共同调控作用。随着对表现型决定因素的深入研究，表观遗传学(Epigenetics)受到越来越多的热点关注。表观遗传学是指:在全基因组DNA序列不发生变化的前提下，基因表达水平与功能发... 展开 个体发育的影响因素不仅仅是由其基因型决定，同时还受到外界环境因素的共同调控作用。随着对表现型决定因素的深入研究，表观遗传学(Epigenetics)受到越来越多的热点关注。表观遗传学是指:在全基因组DNA序列不发生变化的前提下，基因表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。表观遗传学可以通过对细胞分裂的基因调控作用而对生物体的表现型产生影响。表观遗传信息受外界环境的控制，在基因型和表型的关系中是重要的调控者。作为一种重要的表观遗传机制，DNA甲基化可以不依靠改变基因组序列，而达到调控基因表达和改变基因活性的目的。胞嘧啶甲基化和表型可塑性之间的密切联系已经在多种生物体中被证实。 二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)是一种世界范围内的农业害螨，分布范围广，并包含两个不同的色型:红色型(TuR)和绿色型(TuG)。大量研究证明红色型和绿色型有相似的遗传背景，从而提出两种色型的发生可能是由于转录水平的差异造成，既像是DNA甲基化的表观遗传修饰导致的，而不是基因组的分化。因此，研究发育分化过程中DNA甲基化的变化，探究在不同阶段DNA甲基化的作用，是解决两种色型的表观遗传差异与DNA甲基化之间是否存在关联的途径。 首先，我们以TuG作为实验材料，采用优化后的Promega试剂盒提取了高质量的二斑叶螨基因组DNA，满足MSAP反应要求，对连接、预扩增及选择性扩增进行条件优化，建立适合于二斑叶螨基因组DNA甲基化多态性研究的MSAP反应体系，并利用该体系在32对选扩引物中筛出12对适于二斑叶螨分析的最佳引物组合。 然后，将TuR和TuG用MSAP技术对两者的全基因组甲基化差异进行比较分析。在该实验中，我们运用了MSAP优化后体系得到的12对引物，实验结果得到588条重复率高、稳定性好的甲基化条带，其中包含421(72％)条甲基化敏感性位点，338条(80％)多态性位点。通过香浓多样性指数（I)，评估两种色型之间的表观遗传多样性和遗传多样性水平。个体之间和种群之间的分化模式用msap包中基于Nei氏遗传距离的主坐标分析(principal coordinates analysis，PCoA)进行研究讨论。利用分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)分析种群之间的变异，并用表观遗传种群分化((O)ST)值来判断其显著性。本研究的初步研究结果如下: 1.PCoA和AMOVA结果均证明两种色型之间存在不同水平的表观遗传分化。此外两种色型的香浓多样性指数(I)近乎相等(TuG I=0.64±0.06; TuR I=0.65±0.05)，从而可以证明在每一种色型在各自的发育过程中的不同发育阶段分化程度相似。 2.在TuR和TuG生长发育的过程中，两者的甲基化水平变化趋势相同，AMOVA结果表明TuG中幼螨和成螨之间分化程度最大((O)ST=0.27)，TuR中得到的幼螨和若螨之间分化程度最大((O)ST=0.06)。PCoA分析结果可以将TuG中不同的发育阶段分开，在TuR中却不可以。 3.在两种色型相同发育阶段之间的比较中发现，msap得到的AMOVA结果表明两种色型的雌成螨阶段存在显著性表现遗传分化((O)ST=0.50 P=0.03)，并且TuR的雌成螨发育阶段分化程度高于其他发育阶段，且差异水平显著((O)ST=0.06 P=0.04)。PCoA结果得到两种色型的卵和雌成螨之间分别存在表观遗传差异。 最后，分别采用免疫荧光技术和显微注射甲基化抑制剂(5-azacytidine，5-azaC)两种手段，辅助证明了TuR和TuG中5-甲基胞嘧啶(5mC)的存在，以及主要分布于卵巢、卵母细胞、输卵管等生殖相关的组织区域，并且对注射5-azaC前后二斑叶螨的数据统计分析，得到注射后二斑叶螨5 mC水平显著性降低。 收起