摘要: 目的: 1、兔股骨头坏死模型制备:通过液氮冷冻法制备兔股骨头坏死模型，探讨兔股骨头坏死的病理学变化过程，为研究股骨头坏死提供更多可参考的造模方法。 2、淫羊藿苷浓度筛选:通过检测不同浓度淫羊藿苷体外诱导骨髓间充质干细胞在不同时间点促... 展开 目的: 1、兔股骨头坏死模型制备:通过液氮冷冻法制备兔股骨头坏死模型，探讨兔股骨头坏死的病理学变化过程，为研究股骨头坏死提供更多可参考的造模方法。 2、淫羊藿苷浓度筛选:通过检测不同浓度淫羊藿苷体外诱导骨髓间充质干细胞在不同时间点促进细胞增殖和分化的效果，筛选出最佳浓度和最佳时间。 3、兔股骨头坏死研究:在液氮冷冻法成功制备兔股骨头坏死的模型的基础上，联合髓芯钻孔减压术，在保障细胞活性与数量的前提下，将经淫羊藿苷体外诱导的骨髓间充质干细胞植入股骨头坏死减压区，以期达到阻止骨破坏和促使新骨形成，增强修复成骨能力，提高股骨头坏死治疗效果，为临床探索股骨头坏死治疗方案提供理论支持。 方法: 1.淫羊藿苷诱导兔骨髓间充质干细胞的实验研究:取生长1周健康新西兰白兔体外提取骨髓间充质原代干细胞进行培养，选取具有较高繁殖力的二代骨髓间充质干细胞，经0～10μMol淫羊藿苷体外诱导24h、48h、72h，制作各浓度各时间点样本，经MTT检测、ALP活性检测、ALP染色、茜素红染色等技术检测，结合荧光定量PCR测定BMP2、COL-1、OPN基因上调情况、western blot技术测定BMP2、COL-1、OPN蛋白表达影响。所得数据经统计学统计分析，筛选出最佳浓度、最佳时间点淫羊藿苷体外诱导出最佳活性和增殖能力的干细胞，与能够提供营养并保持细胞活性的载体基质胶混合备用，基质胶冷冻保存呈液体，在22～35℃能够快速成胶。 2.淫羊藿苷体外诱导骨髓间充质干细胞移植修复股骨头坏死的实验研究:选取60只健康成年兔纳入本实验，将其分为A组（空白对照12只），B组（模型组12只），C组（髓芯减压治疗组12只），D组（髓芯减压联合骨髓间充质干细胞移植治疗组12只），E组（髓芯减压联合淫羊藿苷诱导形成骨髓间充质干细胞治疗组12）。采用改良式液氮冷冻法制备股骨头坏死兔的动物模型，术后2周随机取3只实验兔，麻醉下行X线、螺旋CT检查后采用耳缘静脉空气栓塞处死，解剖取材，行Micro-CT检查及病理组织形态学检测，多项检测确保造模成功。减压组、干细胞组、淫羊藿苷组分批行髓心钻孔减压术，干细胞组、淫羊藿苷组在股骨头坏死减压区注入骨髓间充质干细胞、经过淫羊藿苷诱导骨髓间充质干细胞，各实验组分别于术后2周、4周、8周随机取3只实验兔在麻醉下行X线、螺旋CT检查，行耳缘静脉空气栓塞处死，解剖取材，行Micro-CT Micro-CT三维重建及骨微观结构参数计算、病理组织学HE染色、免疫荧光等技术检测股骨头坏死区的修复情况。各组所得数据进行统计学分析，得出结论。 成果: 1、采用液氮冷冻法成功制备兔股骨头坏死模型:通过影像学及病理组织形态学检测证实了液氮冷冻术后2周即出现兔股骨头坏死的典型表现，并获得各实验组股骨头坏死病理演变过程的客观数据。 2、成功提取、培养骨髓间充质干细胞，筛选出了淫羊藿苷诱导骨髓间充质干细胞的最佳浓度和最佳时间点，选定了基质胶和诱导后干细胞混合物以保障植入坏死区细胞活性的方法。 3、成功获得各组兔股骨头坏死各时间点检测指标原始数据，经统计分析差异显著，有统计学意义，为临床股骨头坏死的研究提供了理论支持。 结论: 1、液氮冷冻法制备兔股骨头坏死模型，术后2周经影像学及病理组织形态学检测股骨头骨小梁变细稀疏，排列混乱并有部分断裂，骨髓腔内造血细胞减少，细胞变性死亡，空骨陷窝明显增多，此类骨细胞轮廓消失、核固缩，髓腔内充血、凝血，并有大量坏死组织碎片存在，股骨头负重区骨陷窝内软骨细胞萎缩、核固缩，为股骨头坏死病理学的典型表现，证实了液氮冷冻术后2周即可制备兔股骨头坏死模型。 2、0～10μMol淫羊藿苷体外诱导二代骨髓间充质干细胞24h、48h、72h的检测结果显示:淫羊藿苷作用于骨髓间充质干细胞48h，随着浓度的增加，骨髓间充质干细胞数目增加，在48h内淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞有增殖作用，在1州时增殖活性最高。淫羊藿苷作用时间为72h时，BMSCs的增殖能力下降，分化能力增强。淫羊藿苷促进间充质干细胞增殖和风化的最佳浓度是1μMol，最佳时间点是48h。 3、通过Micro-CT对股骨头内部微观结构观察，模型组股骨小梁结构紊乱稀疏、间距增宽、数量减少，部分存在骨小梁骨折，股骨头骨形态变小，骨矿盐密度明显减少，而经过治疗的髓芯减压组，骨髓间充质干细胞组，淫羊藿苷组股骨头坏死病变都有所改善，且淫羊藿苷组效果最好。以上结果表明，淫羊藿苷联合骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死效果明显，淫羊藿苷通过诱导骨髓间充质干细胞增殖及成熟来发挥治疗作用的。统计学统计Micro-CT扫描所得骨结构主要参数、病理形态学、免疫荧光技术分析，髓芯减压联合淫羊藿苷诱导骨髓间充质干细胞治疗组的疗效显著优于髓芯减压联合骨髓间充质干细胞移植治疗组、髓芯减压治疗组、模型组。初步证实了髓心减压过程中注入经淫羊藿苷体外诱导的骨髓间充质干细胞明显促进了股骨头坏死的修复。 收起