摘要: 目的：研究淫羊藿苷联合矿化胶原对超生理剂量糖皮质激素作用下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCS)成骨、成脂分化的影响，并初步探讨相关基因的表达作用。 方法： 1.在规范操作下采用全骨髓贴壁培养法分离、获取4只SPF级别大鼠的BMSCS，并进行纯化、... 展开 目的：研究淫羊藿苷联合矿化胶原对超生理剂量糖皮质激素作用下大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCS)成骨、成脂分化的影响，并初步探讨相关基因的表达作用。 方法： 1.在规范操作下采用全骨髓贴壁培养法分离、获取4只SPF级别大鼠的BMSCS，并进行纯化、传代培养，期间通过倒置相差显微镜观察进行细胞的形态学鉴定。选取生长状态良好的细胞分别通过成骨、成脂、成软骨诱导分化培养及染色进行细胞鉴定，确定本部分实验所提取细胞为大鼠BMSCS。 2.选取SPF级别健康昆明小鼠20只、大鼠10只和新西兰大白兔5只，然后分别进行矿化胶原降解产物的急性全身毒性实验、致敏实验、致热源实验,以确定该材料的生物安全性。 3.选取第三代生长良好的大鼠BMSCS分五组进行实验：对照组(A组)、激素组(B组)、淫羊藿苷+激素组(C组)；矿化胶原+激素组(D组)、矿化胶原和淫羊藿苷+激素组(E组)。对照组仅用DMEM培养基培养，含激素各组的激素用法为1×10-6mol/L的地塞米松，含淫羊藿苷各组用法为1×10-5mol/L的淫羊藿苷，含矿化胶原各组用法为10mg/mL矿化胶原降解液。以上五组各自培养，2周后提取各组RNA，对Runx-2、Osterix、PPARγ、C/EBPα进行实时荧光定量PCR检测。对各组细胞进行油红O、茜素红染色，观察并记录各组细胞分化情况。 结果： 1.实验第一部分提取的细胞在提取24h后部分贴壁，60h后几乎完全贴壁。贴壁后细胞多为长梭形聚集生长，整体形态逐渐呈鱼群状、漩涡状排列，故在形态学观察上符合BMSCS的生长特征。多向诱导分化方面，成骨诱导分化茜素红染色、成脂诱导分化油红O染色、成软骨诱导分化阿利新蓝染色均为阳性反应，表明该细胞具有多向分化的潜能。 2.矿化胶原材料无急性全身毒性、无致敏性、无热源反应。证明矿化胶原具有良好生物安全性，为下一步进行细胞分化影响的研究及后期动物模型实验研究奠定了一定基础。 3.成骨基因表达相关检测：B组中Runx-2、Osterix在基因水平的表达显著低于其他各组，差异具有统计学意义(p＜0.05),且联合用药E组的成骨基因表达高于C组、D组，差异具有统计学意义(p＜0.05)。成脂基因表达相关检测：B组中PPARγ、C/EBPα在基因水平的表达明显高于其他各组，差异具有统计学意义(p＜0.05)，且联合用药E组成脂基因表达低于C组、D组，差异具有统计学意义(p＜0.05)。细胞病理学染色结果显示，与成骨分化相关的茜素红染色只有B组为阴性，其余各组均为阳性，E组联合用药处理阳性结果更明显；与成脂分化相关油红O染色只有B组为阳性，其余各组则为阴性表现。 结论： 1.超生理剂量糖皮质激素可以通过抑制成骨相关基因(Runx-2、Osterix)的表达，增强成脂相关基因(PPARγ、C/EBPα)的表达，进而促使BMSCS向成脂方向分化，抑制成骨方向分化，这可能在激素性ONFH的发病、发展过程中起到了关键作用。 2.矿化胶原、淫羊藿苷分别应用或联合应用时，可通过调控相关成骨(Runx-2、Osterix)、成脂基因(PPARγ、C/EBPα)的表达，减弱超生理剂量糖皮质激素的毒副作用，从而刺激大鼠BMSCS成骨分化的能力，同时抑制其成脂分化，并且二者联合应用效果更好。这为激素性ONFH的早期防治拓展了新的思路及方法。 收起