摘要: 研究背景： 随着现代社会的发展，骨缺损的发生率逐渐增加。虽然骨组织具有一定的自我修复功能，但当骨缺损的尺寸较大时，骨缺损将无法自我修复。造成大节段骨缺损的原因多种多样，治疗方法复杂，这对骨科医生来说是一个挑战和难题。随着骨组织工... 展开 研究背景： 随着现代社会的发展，骨缺损的发生率逐渐增加。虽然骨组织具有一定的自我修复功能，但当骨缺损的尺寸较大时，骨缺损将无法自我修复。造成大节段骨缺损的原因多种多样，治疗方法复杂，这对骨科医生来说是一个挑战和难题。随着骨组织工程(bonetissueengineering,BTE)的发展，多种生物材料在治疗骨缺损的方面有良好的表现。其中矿化胶原就是一种良好的生物仿生材料。矿化胶原是通过模拟骨组织中的成分制备的仿生材料，具有良好的生物相容性。但是其降解速率较快，不具备良好的药物释放能力，因此不适合作为药物载体。研究表明海藻酸盐可以提高矿化胶原的矿化效率，优化矿化胶原的降解和药物释放性能。此外，具有良好促进成骨活性的药物也是BTE中治疗大节段骨缺损的重要一环。近些年来中医中药在BTE中得到了广泛的深入研究。许多中药包含多种生物活性成分，能够发挥多种生物学作用。淫羊藿苷(icariin,ICA)作为多年用于骨科疾病的中药之一，具有促进成骨分化，抑制破骨细胞相关基因表达，促进血管生成的功能，对骨缺损的修复有明显的效果。因此，开发一种缓释ICA的改良矿化胶原支架治疗大节段骨缺损可能是一种有效的治疗方法。 研究目的： ICA是从中草药淫羊藿中分离得到的一种黄酮苷，具有促进成骨和血管生成的作用。既往研究表明ICA通过诱导BMP-2的表达和NO的产生促进体外成骨细胞的形成和血管生成，并且ICA能通过增加OPG/RANKL来减少破骨细胞的形成进而减少骨吸收，治疗骨质疏松。但是由于药物的半衰期和全身给药方式，ICA在骨缺损局部中不能持续维持在适当浓度，降低了其治疗效果。近些年来BTE的快速发展为骨缺损的局部药物治疗提供了便利。因此，本研究使用具有良好生物相容性的海藻酸盐/矿化胶原凝胶作为ICA的负载体系，并且通过联合钛金属多孔支架为骨缺损部位提供机械支撑。本研究目的为验证钛金属多孔支架联合海藻酸盐/矿化胶原/ICA凝胶(alginate/mineralizedcollagen/ICA/porousTi,AMCI/PTi)在体外的相容性、生物活性和该体系对于大节段骨缺损的治疗作用。 研究方法： 1.在室温下将合适浓度的ICA与矿化胶原溶液相混合后加入海藻酸盐获得载药水凝胶；并将载药水凝胶填充于3D打印微孔钛合金支架的微孔隙中，获得AMCI/PTi支架。通过扫描电镜观察材料的支架的微孔结构特征,并且通过药物释放实验和降解实验研究AMCI/PTi支架的药物释放和凝胶降解性能。 2.通过在体外环境与骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)共培养后进行细胞增殖实验和活死细胞染色验证AMCI/PTi支架的生物相容性；通过碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)染色，实时定量聚合酶链反应(real-timequantitativepolymerasechain,RT-qPCR)验证AMCI/PTi支架对BMSCs成骨分化以及成骨相关基因表达的影响；通过小管形成实验，划痕实验和RT-qPCR实验验证AMCI/PTi支架对于人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVECs)的血管生成能力的影响。 3.通过体内研究验证AMCI/PTi支架的骨再生效果。我们通过桡骨截骨术建立兔桡骨大节段骨缺损模型后随机分为三组：单纯微孔钛金属支架组(Ti)和填充空白水凝胶的微孔钛合金支架组(AMC/PTi)和载有ICA的水凝胶填充的微孔钛合金支架组(AMCI/PTi)。将各组支架植入兔桡骨缺损中，通过Micro-CT，X-ray，组织学染色分析以及免疫组化分析研究该复合体系在体内环境下的骨再生效果。 研究结果： 1.通过上述方法成功制备了AMCI/PTi复合体系支架，随后扫描电镜结果显示3D打印微孔钛合金支架的孔径约为600μm，孔隙率70%，并且复合支架具有良好的规则均匀的多孔结构。药物释放实验结果表明AMCI/PTi支架可在4周内持续释放ICA，能够在局部维持合适的药物浓度。凝胶降解实验结果表明AMC凝胶在体内降解周期为50天左右，符合骨组织再生的时间。 2.在细胞增殖实验和活死染色实验中，各组均显示了良好的生物相容性，并且AMCI/PTi支架能够明显的促进BMSCs的增殖。在成骨实验中，AMC/PTi支架组和AMCI/PTi支架组都明显地促进了BMSCs的成骨分化，上调成骨相关基因的表达，但是AMCI/PTi支架组有最佳的效果。通过血管生成的相关实验表明，AMCI/PTi支架组能够促进内皮细胞的迁移，促进血管生成和上调血管生成相关基因的表达。 3.在体内实验中，我们成功地建立了兔桡骨大节段骨缺损模型，在各组术后12周的X-ray，Micro-CT检测以及组织学染色结果显示，相比较于Ti支架组，AMC/PTi支架组和AMCI/PTi支架组都促进了骨缺损处的骨再生，并且AMCI/PTi支架组的效果优于AMC/PTi支架组。此外，免疫组化分析显示AMCI/PTi支架组以及AMC/PTi支架组的阳性细胞数量再生明显多于Ti支架组。并且相比于AMC/PTi支架组，AMCI/PTi支架组的阳性细胞数量更多，表明其促进血管再生和骨修复的作用更强。 研究结论： 本研究通过将载有ICA的海藻酸盐/矿化胶原水凝胶填充于3D打印微孔钛合金支架的微孔结构中构建了一种可以促进大节段骨缺损修复的药物缓释体系。通过体外实验表明该复合体系不仅具有良好的生物相容性、降解性能和药物缓释能力，还能明显的促进体外的血管生成和成骨细胞分化。体内实验表明该复合体系可以促进大节段骨缺损的骨修复效果，并且能够通过促进局部血管地生成增强骨组织的生长，改善局部的血运环境。因此，综合以上结果表明AMCI/PTi支架能够明显地促进兔大节段骨缺损的修复，能够为临床上骨缺损的治疗提供新的方法。 收起