摘要: 骨骼肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤常见于溶栓、Fogarty导管取栓、断肢再植、四肢大血管损伤等恢复血流后，是临床亟待解决的重要问题。调动机体内源性保护机制，是减轻I/R损伤最有效的措施。1986年Murry提出缺血预处理“ischemic prec... 展开 骨骼肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤常见于溶栓、Fogarty导管取栓、断肢再植、四肢大血管损伤等恢复血流后，是临床亟待解决的重要问题。调动机体内源性保护机制，是减轻I/R损伤最有效的措施。1986年Murry提出缺血预处理“ischemic preconditioning(IPC)”的概念。IPC多次短暂的缺血再灌注增强对其之后的较长时间的缺血的耐受性，减轻I/R损伤，已经被成功的应用于临床和实验工作。然而，由于缺血时间不可预测，限制其临床的应用。2003年Zhao提出了缺血后处理的概念(ischemic postconditioning，I-postC)，即在再灌注前立刻给予一次或多次短暂重复心肌I/R，能减轻心肌后续长时间再灌注损伤的现象，该现象在小鼠、大鼠、兔、猪心脏缺血和缺血/再灌注模型上被证实，存在于人类心脏血管重建术后；也存在于脊髓、脑、肠、肝、肺等多种器官组织。这种保护现象可以被短暂的缺氧后处理(hypoxic postconditioning，H-postC)所模拟，具有重要的临床应用价值。外科医生可以在择期手术或者急诊手术时进行I-postC，并且I-postC作为“损伤后策略”易于应用于缺血组织。I-postC的保护机制涉及控制灌注条件、减轻微循环功能障碍、稳定细胞内环境、减轻细胞内钙超载和调动机体内源性应激蛋白(热休克蛋白、自由基清除酶、金属硫蛋白等)的合成上调，阐明其机制具有十分重要的意义。 微循环直接影响组织器官血氧供应及存活状态。微循环功能障碍是I/R的损伤性表现，也是加重实质细胞I/R损伤的重要因素，改善微循环功能是减轻组织I/R损伤的关键环节和重要机制。但尚未有研究直接证实I-postC对微循环的影响。 钙网蛋白(calreticulin，CRT)是内质网(endoplasmic reticulum，ER)/肌浆网内主要的钙结合蛋白，通过协助蛋白质折叠、维持细胞钙稳态参与细胞凋亡调控。钙信号途径是I/R诱导细胞凋亡的关键途径。细胞内钙离子参与调节I/R损伤。最近的研究结果表明，钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)及其许多CaN依赖的途径的功能都依赖ER内Ca2+稳态和ER相关的Ca2+的结合伴侣。CaN又称蛋白磷酸酶2B(protein phosphatases2B，PP2B)，是目前发现的唯一受Ca2+/钙调素(calmodulin，CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶。CaN是一个包含A(CnA)和B(CnB)亚基的的异源二聚体。CaN在多种细胞过程(包括细胞凋亡、胚胎发育、心脏的生理及代谢调控和癌症)中起着重要作用。环孢素A(cyclosporin A，CsA)与内源性cyclophilin形成复合物，可阻断CaN催化作用，从而抑制细胞因子的转录。既往主要关注CaN在心肌肥大中的作用，近年来发现，CaN参与缺血再灌注损伤，但其作用尚有争议。我们前期研究表明CaN参与I-postC保护心肌作用。 基于上述，本工作旨在证实I-postC对于骨骼肌I/R损伤的保护涉及改善微循环的微血管保护和CaN介导的骨骼肌细胞直接保护两个方面。为证实该假说，本工作首先在大鼠后肢I/R损伤模型上证实I-postC对骨骼肌I/R损伤的保护作用及其微血管保护机制；进一步在体外分离培养的大鼠后肢骨骼肌细胞H/R模型上，研究I-postC/H-postC对骨骼肌细胞H/R损伤的保护作用以及CaN介导H-postC骨骼肌细胞保护分子机制。主要实验方法和结果如下： 一、缺血后处理减轻大鼠骨骼肌缺血/再灌注损伤 本部分实验旨在观察I-postC/H-postC对骨骼肌I/R或H/R损伤的保护作用。 整体实验：健康雄性Wistar大鼠随机分为I/R组、I-postC组、IPC组及假手术组。观察各组血流动力学变化，骨骼肌湿干重比值(wet/dry weight ratio，W/D)测定，骨骼肌组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)变化，血浆乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)浓度及骨骼肌形态及超微结构变化。骨骼肌细胞实验：原代培养乳鼠骨骼肌细胞，随机分为(hypoxia/reoxygenation，H/R)组、H-postC组、缺氧预处理(hypoxic preconditioning，HPC)组、正常对照组(CON)。观察各组细胞凋亡率及细胞存活率变化。Western blot分析葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)、CRT以及CaN表达变化。 结果显示：①整体实验：I-postC减轻I/R对心功能的抑制、骨骼肌组织水肿、骨骼肌组织脂质过氧化损伤及血浆LDH浓度，并显著减轻I/R所致骨骼肌结构损伤。I/R诱导GRP78、CRT及CaN表达上升。与I/R组相比，I-postC可诱导GRP78、CRT及CaN表达显著增高。②骨骼肌细胞实验：H/R引起细胞凋亡显著增加，H-postC可显著减轻细胞凋亡率；H/R使细胞存活率降低，H-postC可显著减轻H/R造成的细胞坏死。H/R诱导CRT及CaN表达上升，H-postC可诱导CRT及CaN表达显著增高。 二、缺血后处理通过改善微循环减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤 第一部分实验证实I-postC可以调动机体内源保护机制，减轻I/R所致骨骼肌损伤。但I-postC是否通过改善微循环减轻骨骼肌I/R损伤?这值得深入研究。本部分实验健康雄性Wistar大鼠随机分为I/R组、I-postC组、IPC组及假手术组。采用监测大鼠骨骼肌微循环改变，以及微血管血流速度及血管内径变化以观察I-postC对骨骼肌微循环的影响，探讨I-postC改善骨骼肌I/R损伤的微血管保护机制。 结果显示：①骨髂肌微循环的影响：I/R引起胫前肌微循环障碍，I-postC明显减轻I/R引起的微循环障碍；②微血管血流速度：I/R可引起细静脉流速减慢，I-postC减轻I/R所致细静脉流速减慢；③细动脉内径变化：I/R可引起细动脉挛缩，I-postC减轻I/R所致细动脉挛缩；④细静脉内径变化：I/R可引起细静脉挛缩，I-postC减轻I/R所致细静脉挛缩。 三、钙调神经磷酸酶介导缺血后处理减轻大鼠骨骼肌缺血/再灌注损伤 前述实验在骨骼肌组织和细胞水平上证实I/H-postC可诱导CaN表达增加，且CaN表达与CRT表达呈正相关，这提示我们CRT上调可能介导了I-postC诱导的CaN表达增加。但CaN活性上调与骨骼肌I/R损伤保护及信号通路的相关机制有待于进一步研究。本实验在Wistar大鼠后肢骨骼肌I/R损伤模型和Wistar乳鼠骨骼肌细胞H/R损伤模型上，观察I-postC(H-postC)损伤保护过程中CaN的变化，探讨CaN参与I-postC(H-postC)保护作用；同时采用CaN抑制剂CsA抑制骨骼肌CaN活性及表达，并采用pcDNA3.1-Myc-His(B)(pCDB)-caN过表达CaN，观察抑制或过表达CaN后后处理对骨骼肌I/R(H/R)损伤的影响。 结果发现：①整体实验：CsA显著抑制骨骼肌组织CaN表达及活性，显著抑制I-postC保护作用，骨骼肌水肿加重，MDA及LDH浓度增加，②骨骼肌细胞实验：CsA显著抑制骨骼肌细胞CaN表达及活性，显著抑制H-postC保护作用，细胞凋亡率较H-postC组显著升高，细胞存活率较H-postC组显著降低；转染质粒后，CaN表达及活性明显增强，细胞凋亡率较H-postC组显著降低，细胞存活率较H-postC组显著增高。 通过上述分析，得出如下实验结论：①后处理可以调动机体内源性保护机制，减轻I/R(H/R)所致骨骼肌组织(细胞)损伤。②I-postC对于骨骼肌I/R损伤的保护作用，至少部分是通过改善微循环功能实现的，其机制可能涉及减轻I/R造成的细动脉内皮依赖性血管调节功能障碍、后微血管痉挛和微血管无复流现象，并保护微血管屏障功能。③I-postC可以通过CaN的活化保护大鼠I/R损伤骨骼肌。这些数据揭示了复杂的信号级联参与后处理保护骨骼肌细胞。 收起