摘要: 本研究分为二部分： 第一部分：Clara细胞10-kDa蛋白在呼吸道上皮细胞炎症过程中的作用 实验一、人CC10基因真核表达载体的构建及鉴定 背景：慢性鼻-鼻窦炎和鼻息肉是呼吸道常见的慢性炎症性疾病，它们的发病机制尚未完全阐明。Clara细胞10-... 展开 本研究分为二部分： 第一部分：Clara细胞10-kDa蛋白在呼吸道上皮细胞炎症过程中的作用 实验一、人CC10基因真核表达载体的构建及鉴定 背景：慢性鼻-鼻窦炎和鼻息肉是呼吸道常见的慢性炎症性疾病，它们的发病机制尚未完全阐明。Clara细胞10-Kd蛋白（CC10）是具有抗炎和免疫调节作用的多功能蛋白质。既往研究表明CC10在慢性鼻-鼻窦炎和鼻息肉组织中低表达，可能在疾病的发生发展中起重要作用，但其具体作用机制尚未阐明。基因转染是研究蛋白质功能的重要手段，为研究CC10蛋白在呼吸道炎症性疾病中的作用，本实验构建人CC10真核表达载体，为下一步研究提供重要的帮助。 目的：构建及鉴定人CC10基因真核细胞表达载体。 方法：采用RT-PCR法，从人下鼻甲组织的总RNA中扩增含人CC10编码区全长的Cdna片段，将其连接到pcDNA3.1/V5-His TOPO TA载体中，脂质体法转染CC10质粒到支气管上皮细胞BEAS-2B，免疫荧光细胞化学法及Western blot法检测CC10蛋白的表达。 结果：用菌液PCR法和酶切鉴定质粒并测序，人CC10基因成功克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，体外转染CC10质粒的BEAS-2B细胞中CC10蛋白表达明显增高。 结论：成功构建了CC10基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1-Hcc10，并获得表达。 实验二、Clara细胞10-kDa 蛋白在呼吸道上皮细胞中发挥抗炎作用 背景：Clara细胞10-Kd蛋白（CC10）是具有抗炎和免疫调节作用的多功能蛋白质，既往研究表明CC10在呼吸道炎症性疾病的发病过程中起重要作用。人类支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞是广泛被接受的用于研究呼吸道上皮细胞的模型，基因转染是研究蛋白质功能的重要手段。为研究CC10蛋白在呼吸道炎症性疾病中的作用，本研究以细胞试验为模型，比较未转染与转染了CC10质粒的BEAS-2B细胞系对炎性细胞因子的反应，探讨CC10在呼吸道炎症性疾病中的作用。 目的：用细胞因子IL-1β刺激BEAS-2B细胞建立呼吸道上皮细胞炎症模型，并探讨CC10蛋白能否在呼吸道上皮细胞系炎症模型中起作用。 方法：以细胞试验为模型，用pcDNA3.1或CC10质粒转染BEAS-2B细胞，48小时后再用炎性细胞因子白细胞介素-1（IL-1β，10 ng/ml）作用6 h，采用实时定量（real-time）逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR），酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组下游基因白细胞介素-8（IL-8）的变化。 结果：IL-8在BEAS-2B细胞中基础表达水平较低，转染空质粒和CC10质粒对IL-8的表达无影响，而与空白对照组相比，转染空质粒组的BEAS-2B细胞在IL-1β刺激6 h后IL-8 Mrna上调达150倍，刺激24 h后蛋白上调达62倍，转染CC10质粒的BEAS-2B细胞明显抑制IL-1β诱导的IL-8表达，其对Mrna和蛋白表达的抑制分别达5倍和2倍，差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论：CC10可抑制IL-1β诱导的支气管上皮细胞BEAS-2B IL-8 Mrna和蛋白的表达，CC10蛋白在呼吸道上皮细胞中发挥抗炎作用。 第二部分：Clara细胞10-kDa 蛋白在呼吸道上皮细胞发挥抗炎作用的机制研究 背景：Clara细胞10-Kd蛋白（CC10）是具有抗炎和免疫调节作用的多功能蛋白质。前期试验发现CC10在呼吸道上皮细胞可抑制IL-1β诱导BEAS-2B表达IL-8，但CC10在呼吸道发挥抗炎作用的具体机制还不清楚。IL-1β在呼吸道炎症中可激活核转录因子Κb（NF-Κb），而IL-8基因的表达亦受NF-Κb的调控。因此我们推测CC10在呼吸道上皮细胞发挥的抗炎作用是通过抑制NF-Κb的活化来实现。 目的：确定CC10在呼吸道上皮细胞抑制IL-1β诱导BEAS-2B表达IL-8是否通过抑制NF-Κb的活性来介导，并阐明其作用机制。 方法：采用报告荧光基因和Western blot方法，对CC10转染的BEAS-2B细胞在加入IL-1β刺激后NF-Κb的活性变化进行检测，然后用Western blot方法检测NF-Κb信号通路上游关键因子p-IκB-α和p-IKKα/β，最后用免疫共沉淀法检测NF-Κb亚单位p65蛋白和CC10蛋白是否有相互作用。 结果：报告荧光基因检测结果显示BEAS-2B细胞在加入10 ng/ml的IL-1β作用4 h后NF-Κb的活性与空白对照相比上调达6.6倍，而转染CC10质粒后这种上调效应被抑制，NF-Κb的活性明显下调，达64.7%（P<0.05）。用Western blot方法分别检测BEAS-2B细胞内总的p65在IL-1β刺激和转染前后无变化，BEAS-2B细胞在IL-1β刺激后核内p65蛋白迅速上调，而转染CC10质粒后，核内p65蛋白减少。进一步检测NF-Κb信号通路上游关键蛋白p-IκB-α和p-IKKα/β发现，CC10转染后的BEAS-2B细胞与空质粒转染后的细胞在IL-1β作用后p-IκB-α减少，而p-IKKα/β的量则没有变化。最后用免疫共沉淀法未发现CC10和p65蛋白间有直接作用。 结论：CC10抑制IL-1β诱导BEAS-2B表达IL-8是通过抑制核转录因子Κb来起作用，CC10抑制NF-Κb的活性的作用机制是抑制NF-Κb活化的关键蛋白IκB-α的磷酸化。 收起