摘要: 本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 小鼠细菌性和变应性慢性鼻-鼻窦炎模型的组织学及免疫学特点 目的:建立小鼠细菌性慢性鼻-鼻窦炎模型(BCRS)和变应性慢性鼻-鼻窦炎(ACRS)模型，探讨两种小鼠慢性鼻-鼻窦炎模型的组织学和免疫学特点。... 展开 本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 小鼠细菌性和变应性慢性鼻-鼻窦炎模型的组织学及免疫学特点 目的:建立小鼠细菌性慢性鼻-鼻窦炎模型(BCRS)和变应性慢性鼻-鼻窦炎(ACRS)模型，探讨两种小鼠慢性鼻-鼻窦炎模型的组织学和免疫学特点。 方法:使用肺炎链球菌接种加Merocel窦口鼻道阻塞的方法建立BCRS小鼠模型。卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏，反复多次OVA鼻腔激发12周的方法建立ACRS小鼠模型。采用组织学染色的方法观察两种模型鼻窦黏膜组织学变化:苏木精-伊红(HE)染色显示鼻窦黏膜病理改变和固有层炎性细胞浸润的情况，过碘酸-希夫(PAS)染色显示黏膜上皮的杯状细胞，马森-三色(MT)染色显示上皮下胶原纤维沉积。酶联免疫吸附试验(ELISA)用来检测鼻灌洗液(NLF)中各种细胞因子浓度的溶度。 结果:在BCRS模型小鼠鼻窦黏膜固有层以多型核中性粒细胞浸润(PMN)为主，而在ACRS模型小鼠鼻窦黏膜固有层以嗜酸性粒细胞浸润(EOS)为主。两种模型小鼠的鼻窦黏膜中均出现杯状细胞和上皮下腺体增生，上皮下纤维化，上皮层增厚，以及固有层单个核细胞浸润，并在ACRS模型小鼠程度更重。NLF中白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平在两种模型小鼠中均增加，并在第1周达到峰值。在BCRS模型组，NLF中IL-8和干扰素(IFN)-γ增加，在第1周达到峰值;而在ACRS模型组NLF中IL-5，IL-13和eotaxin均增加，在第1周达到峰值。有意义的是，在ACRS模型组小鼠NLF中IFN-γ也有增加，在第4周达到峰值。 结论:本实验成功地建立了BCRS和ACRS小鼠模型。有利于将来采用遗传学及免疫学的方法进一步阐明CRS的病理机制。 第二部分 CC10在小鼠慢性鼻-鼻窦炎模型中作用机制的研究 实验一 CC10在小鼠慢性鼻-鼻窦炎模型中的表达 目的:观察Clara细胞10-KDa蛋白(Clara cell 10-KDa protein，CC10)在小鼠细菌性慢性鼻-鼻窦炎(bacterial chronic rhinosinusitis，BCRS)及变应性慢性鼻-鼻窦炎(allergicchronic rhinosinusitis，ACRS)模型中的表达。 方法:C57BL/6J小鼠使用肺炎链球菌接种加Merocel窦口鼻道阻塞的方法建立BCRS小鼠模型，卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏及反复多次OVA鼻腔激发12周的方法建立ACRS小鼠模型。用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学、组织病理染色及图像分析方法检测小鼠鼻窦黏膜组织CC10 mRNA及蛋白水平表达、CC10阳性细胞数及鼻窦黏膜形态学参数。 结果:BCRS组小鼠鼻窦黏膜固有层内多型核中性粒细胞数(PMN)、上皮下胶原纤维沉积、上皮厚度及杯状细胞数等均较对照组增多(P＜0.05），BCRS组小鼠鼻窦黏膜上皮CC10阳性细胞数、CC10mRNA及蛋白表达等均较对照组减少(P＜0.01)。ACRS组小鼠鼻窦黏膜固有层内嗜酸性粒细胞、上皮下胶原纤维沉积、上皮厚度及杯状细胞数等均较对照组增多(P＜0.05），ACRS组小鼠鼻窦黏膜上皮CC10阳性细胞数、CC10mRNA及蛋白表达等均较对照组减少(P＜0.05)。 CC10阳性细胞数分别与黏膜固有层PMN数、EOS数、固有层胶原纤维沉积、上皮杯状细胞数及上皮厚度呈显著负相关，相关系数分别为-0.734 (P＜0.05)，-0.639 (P＜0.05)，-0.776 (P＜0.05)，-0.841 (P＜0.05)和-0.805(P＜0.05)。CC10平均灰度值分别与黏膜固有层PMN数、EOS数、固有层胶原纤维沉积、上皮杯状细胞数及上皮厚度呈显著正相关，相关系数分别为0.771(P＜0.05），0.752 (P＜0.05), 0.802(P＜0.05), 0.887(P＜0.05)和0.855 (P＜0.05)。 结论:小鼠BCRS和ACRS模型鼻窦黏膜中CC10表达均下调。 CC10作为一种内源性负调控蛋白可能参与慢性鼻-鼻窦炎的发病过程。 实验二 CC10在小鼠慢性鼻-鼻窦炎模型中作用机制 目的:揭示Clara细胞10-KDa蛋白(Clara cell 10-KDa protein，CC10)在小鼠细菌性慢性鼻-鼻窦炎(BCRS)及变应性慢性鼻-鼻窦炎(ACRS)模型中的作用，研究布地奈德(budesonide，BUD)对小鼠慢性鼻-鼻窦炎(CRS)模型中的CC10表达的调控。 方法:用基因敲除技术敲除CC10基因，得到CC10敲除(knockout，KO)小鼠。用野生型和CC10-KO小鼠分别建立BCRS小鼠模型和ACRS小鼠模型。随机分成对照组、模型组和BUD治疗组。BUD治疗组给予BUD鼻腔滴鼻干预。组织病理染色及图像分析方法检测小鼠鼻窦黏膜组织形态学参数，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学检测鼻窦黏膜组织CC10 mRNA及蛋白水平表达、CC10阳性细胞数。 结果:CC10-KO小鼠的BCRS模型组鼻窦黏膜固有层内多型核中性粒细胞数(PMN)、上皮下胶原纤维沉积、上皮厚度及杯状细胞数等均较野生型增多(P＜0.05); 同样，CC10-KO小鼠的ACRS模型组鼻窦黏膜固有层内嗜酸性粒细胞数(EOS)、上皮下胶原纤维沉积、上皮厚度及杯状细胞数等均较野生型增多(P＜0.05)。与模型组相比，两种CRS模型的BUD治疗组的鼻窦黏膜的病变程度明显减轻(P＜0.05)，但CC10-KO小鼠缓解程度明显弱于野生型小鼠。两种CRS模型小鼠鼻窦黏膜上皮CC10阳性细胞数、CC10mRNA及蛋白表达等均较对照组减少(P＜0.05)，并在ACRS模型组下调更明显(P＜0.05)。而在BUD治疗组CC10阳性细胞数、CC10mRNA及蛋白表达等与模型组相比均增高(P＜0.05)。 结论:CC10作为一种内源性抗炎因子参与小鼠BCRS及ACRS模型的发病过程。糖皮质激素可能通过上调鼻窦黏膜中CC10的表达发挥治疗CRS作用。 第三部分 表达谱基因芯片方法筛选小鼠慢性鼻-鼻窦炎模型中CC10相关基因的研究 目的:筛选小鼠细菌性慢性鼻-鼻窦炎(BCRS)及变应性慢性鼻-鼻窦炎(ACRS)模型中CC10相关基因。 方法:采用野生型和CC10-KO小鼠建立BCRS小鼠模型和ACRS小鼠模型，随机分成对照组、模型组。提取各组小鼠鼻窦黏膜中的总RNA，用基因表达谱芯片技术比较各组差异表达的基因以确定CRS中CC10相关基因，并用实时定量RT-PCR方法进行验证。 结果:通过筛选比较，我们发现BCRS模型中CC10相关基因共有109个，KBS组和WBS组相比较，上调85个，下调24个; ACRS发病过程中CC10相关基因，共有180个基因，KAS组和WAS组相比较，上调152个，下调28个。筛选出的基因包括与代谢、离子转运、信号转导、细胞增生、炎性反应趋化、先天免疫反应等等相关基因，还有数量众多的功能未知的基因。实时定量RT-PCR结果显示IL-1β，MIP-1α，IL-5，TLR-2，Ube3a，Socs3的变化与基因芯片的结果一致。 结论:应用基因芯片技术发现众多CC10相关基因，有利于将来进一步研究CC10在了CRS的发病过程的作用机制。 收起