摘要: 目的: 1.基因芯片筛选人类卵母细胞从GV期到MII期microRNA谱的变化 2.RT-PCR验证基因芯片中卵母细胞差异表达的microRNA 材料与方法: 收集2008年8月～2010年2月在中山大学附属第一医院生殖中心行ICSI治疗患者的不成熟卵母细胞。 透明质... 展开 目的: 1.基因芯片筛选人类卵母细胞从GV期到MII期microRNA谱的变化 2.RT-PCR验证基因芯片中卵母细胞差异表达的microRNA 材料与方法: 收集2008年8月～2010年2月在中山大学附属第一医院生殖中心行ICSI治疗患者的不成熟卵母细胞。 透明质酸和机械法去除颗粒细胞后的卵母细胞放入trizol中-80℃保存。然后进行microRNA芯片实验，检测GV与MII期卵母细胞microRNA的表达情况。GV期与MII期卵母细胞各三组，每组20个。共可获6张芯片的数据。以倍数改变大于1.5倍，t检验中P＜0.05的基因定为有差异表达。 应用单细胞荧光定量PCR技术在GV期和MII期验证芯片结果。选择了GV期到MII期表达水平发生上调变化的miR-602，以及发生下调变化的miR-15a和miR-20a。细胞保存条件：透明质酸和机械法去除颗粒细胞，将单个卵母细胞放入溶解液中，-20℃保存。 验证芯片实验结果后，进一步检测来源于以下4组的卵母细胞中miR-15a，miR-20a和miR-602的动态表达情况。 GV组：ICSI患者GV期的卵母细胞； MI组：ICSI患者MI期的卵母细胞； MII组：TCM199+1.0iu/mlHCG+10％SPS+5.5 ng/ml FSH培养至MII期的卵母细胞；HMII组：TCM199+1.0iu/mlHCG+10％SPS+2000ng/ml FSH培养至MII期的卵母细胞实验采用以质量单位作为标准进行相对定量的△CT法和有参照基因的2-△△CT法两种方法。统计分析采用t检验与one-way ANOVA方差分析，P＜0.05差异有统计学意义，统计软件采用SPSS.13.0。 结果: 在miRNA芯片的分析中，MII组与GV组相比，共有15个microRNA出现差异性表达，其中4个microRNA的表达发生了上调，11个microRNA的表达下调。 单细胞荧光定量PCR的结果中，MII组与GV组相比，hsa-miR-15a的平均倍数改变为0.19，芯片结果中的倍数改变为0.31；hsa-miR-20a的平均倍数改变为0.06，芯片结果中的倍数改变为0.47；hsa-miR-602的平均表达水平上调了5.28倍，而芯片结果中为上调5.01倍。定量PCR数据与芯片数据基本一致。 在miR-15a，miR-20a和miR-602的动态表达情况的研究中，与GV组相比，MI组、MII组和HMII组的hsa-miR-15a相对平均倍数改变分别为：1.380、0.074和0.155，其中MII组、HMII组的平均倍数改变均有显著性差异(P值均小于0.001)。MII组和HMII组两组比较中，HMII组的hsa-miR-15a表达水平高于MII组(P=0.034)。 与GV组相比，MI组、MII组、HMII组的hsa-miR-20a相对平均倍数改变分别为：1.074、0.060和0.320。其中MII组、HMII组的平均倍数改变均有显著性差异(P值分别为小于0.001和0.022)。MII组和HMII两组的比较中，HMII组的hsa-miR-20a表达水平高于MII组(P=0.003)。 hsa-miR-602的表达水平在各组间也是呈动态改变的，其变化趋势与芯片结果相吻合。 与GV组相比，MI组、MII组、HMII组的hsa-miR-602的相对平均倍数改变分别为：0.963、1.033和0.520，各组间平均倍数的改变无显著性。以miR-16为内参的两次实验表明，GV与MII组△CT的差异有统计学意义(P=0.006)。MII与HMII两组的比较中，MII组中hsa-miR-602的表达水平高于HMII组(P＜0.010)。 结论: 1.在卵母细胞发育过程中，部分microRNA的表达有显著的变化，并随着减数分裂的不同阶段呈动态改变。 2.培养液中FSH浓度的升高导致microRNA的表达水平发生显著改变。 3.microRNA表达谱芯片可以作为初步筛选目标基因的有效手段。 4.RT-PCR技术可以成功运用于单个卵母细胞microRNA表达水平的研究。 收起