摘要: 中枢神经系统退行性疾病一直以来是困扰着人类的一大类疾病。其中，发病率最高的阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)和帕金森病(Parkinson's disease，PD)是危害中老年人身心健康的两种重要疾病。AD、PD的病因和发病机制目前尚不清楚。近年来大量... 展开 中枢神经系统退行性疾病一直以来是困扰着人类的一大类疾病。其中，发病率最高的阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)和帕金森病(Parkinson's disease，PD)是危害中老年人身心健康的两种重要疾病。AD、PD的病因和发病机制目前尚不清楚。近年来大量的研究表明，中枢神经系统免疫功能异常与AD、PD发病密切相关。中枢神经系统免疫异常主要表现为小胶质细胞过度活化，分泌大量细胞毒性物质，如一氧化氮(Nitric Oxide，NO)，细胞因子，兴奋性氨基酸，活性氧自由基，花生四烯酸及其代谢产物等。这些细胞毒性物质均参与了神经元的退变过程，因此抑制小胶质细胞激活的药物便具有间接的神经保护作用。 褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是褐藻来源的天然硫酸多糖，其主要成分是结合有硫酸基的岩藻糖，已经发现它具有抗凝、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种生物活性。我们实验室的前期工作发现：在离体和整体PD模型中，海带褐藻多糖硫酸酯具有明确的神经保护作用，进一步的研究证明褐藻多糖硫酸酯的抗氧化活性参与了其神经保护作用，作用机制可能为清除自由基、抑制脂质过氧化和提高抗氧化系统的活性。为了进一步探讨海带褐藻多糖硫酸酯的神经保护作用的机制，研究其抗炎作用是否参与上述神经保护过程，本研究以革兰氏阴性细菌细胞壁脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激原代培养的小胶质细胞建立炎症细胞模型，就海带褐藻多糖硫酸酯的抗炎活性及其机制进行了实验观察与研究，主要结果如下： 1.小胶质细胞炎症模型的建立 应用不同剂量(0，0.001μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1μg/ml，10μg/ml)LPS作用于原代培养的小胶质细胞不同时间(3h，6h，12h，24h，48h)，通过Griess反应检测细胞培养上清液中NO的生成，确定了0.01μg/ml LPS作为诱导小胶质细胞炎症模型的有效剂量，LPS作用24h作为检测NO生成量的时间点。 2.海带褐藻多糖硫酸酯保护剂量的确定 应用不同剂量(31.25μg/ml，62.5μg/ml，125μg/ml，250μg/ml，500μg/ml)的海带褐藻多糖硫酸酯分别作用于原代培养的小胶质细胞24h，通过Griess反应和四甲基偶氮唑兰(3—(4，5—Dimethylthiazol-2-yl)—2,5—diphenyltetrazolium bromide，MTT)反应分别检测细胞培养上清液中NO的生成和细胞活力，确定了31.25μg/ml，62.5μg/ml，125μg/ml对NO的生成和细胞活力均无影响，可作为研究褐藻多糖硫酸酯保护作用的剂量。 3.海带褐藻多糖硫酸酯抑制NO生成和iNOS的表达 应用31.25μg/ml，62.5μg/ml，125μg/ml海带褐藻多糖硫酸酯预孵育原代培养的小胶质细胞10min，而后加入0.01μg/ml LPS作用24h，发现62.5μg/ml，125μg/ml海带褐藻多糖硫酸酯剂量依赖的方式抑制LPS引起的NO生成增加。用RT-PCR的方法检测细胞内可诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric OxideSynthase，iNOS)的mRNA水平，发现125μg/ml海带褐藻多糖硫酸酯在转录水平抑制iNOS的表达。用Western blot方法检测细胞内iNOS的蛋白表达，发现31.25μg/ml，62.5μg/ml，125μg/ml海带褐藻多糖硫酸酯均可以抑制LPS引起的iNOS表达上调，且随着海带褐藻多糖硫酸酯浓度的增加抑制作用逐渐增强。 4.海带褐藻多糖硫酸酯抑制小胶质细胞形态变化 应用正常培养基，0.01μg/ml LPS，62.5μg/ml海带褐藻多糖硫酸酯和0.01μg/ml LPS分别作用于原代培养的小胶质细胞24h，CD11b免疫组织化学的方法检测小胶质细胞的形态，发现62.5μg/ml海带褐藻多糖硫酸酯可以抑制LPS引起的小胶质细胞形态变化。 5.海带褐藻多糖硫酸酯抑制TNFα，释放用酶联免疫吸附试验(enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA)检测细胞合成和分泌促炎因子肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα，TNFα)水平，发现125μg/ml的海带褐藻多糖硫酸酯可以拮抗0.01μg/ml LPS诱导的小胶质细胞TNFα释放。 6.MAPKs与NO和TNFα生成的关系 丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen—activated protein kinases，MAPKs)家族包括ERK(extracellular signal—regulated kinase)，p38和JNK(c—Jun NH2-Terminal kinase)，参与多种细胞内信号反应。为了研究MAPKs家族与NO和TNFα生成之间的关系，我们分别应用ERK的抑制剂PD98059，p38的抑制剂SB203580和JNK的抑制剂SP600125作用于原代培养的小胶质细胞30 min，0.01μg/ml LPS作用24h，应用Griess反应检测NO生成量的变化，发现ERK，p38，JNK均参与NO生成的调节，而p38和JNK的作用更明显一些。分别应用ERK的抑制剂PD98059，p38的抑制剂SB203580和JNK的抑制剂SP600125作用于原代培养的小胶质细胞30 min，0.01μg/ml LPS作用6h以后，ELISA方法检测TNFα分泌水平的变化，发现只有p38参与TNFα的合成。 7.海带褐藻多糖硫酸酯对MAPKs家族磷酸化的影响 用Western blot方法检测细胞内MAPKs家族中ERK，p38和JNK的磷酸化水平，发现0.01μg/ml LPS明显增加ERK，JNK和p38的磷酸化水平，海带褐藻多糖硫酸酯可以明显抑制p38和ERK的磷酸化，但是对JNK的磷酸化影响不明显。 结论:本研究首次发现天然海洋药物褐藻多糖硫酸酯在LPS诱导的炎症小胶质细胞模型中表现出了一定的抗炎作用，且进一步阐明其抗炎活性主要是通过抑制MAPKs家族中的p38，ERK的磷酸化而得以实现的。沿着这一方向继续深入研究可能会开发出具有中国自主知识产权的神经保护药物，为防治PD等神经退行性疾病提供新的选择。 收起