摘要: 目的：研究不同来源成骨细胞体外培养的形态特征和生物学活性，探讨成骨细胞分离培养的最佳方法及作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值，为骨组织工程的研究提供稳定可靠的种子细胞来源。方法：无菌条件下取新生新西兰兔胫骨骨膜和骨髓，PBS冲洗... 展开 目的：研究不同来源成骨细胞体外培养的形态特征和生物学活性，探讨成骨细胞分离培养的最佳方法及作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值，为骨组织工程的研究提供稳定可靠的种子细胞来源。方法：无菌条件下取新生新西兰兔胫骨骨膜和骨髓，PBS冲洗3次，0.25％胰蛋白酶消化20分钟，以彻底去除残留在组织块上的血污，再将骨膜剪成大小约为1×1mm的组织块，将骨膜组织块放入25ml培养瓶中，加入含10％小牛血清的高糖DMEM培养液2ml，细胞长满瓶底后进行传代培养。注射器肝素化后抽取完全DMEM培养液冲洗骨髓腔，将混合DMEM培养液加入到无菌离心管内，1000转/分钟离心，去除最上面的脂肪层，以1×106/cm2密度接种于100ml培养瓶中进行原代细胞培养。3天后全量换液，细胞汇合成单层后用0.25％胰蛋白酶消化细胞进行传代培养。细胞传代后改用含地塞米松(1×10-8mol/l)、β-甘油磷酸钠(10mmol/l)、维生素C(50mg/ml)的条件培养液培养。取第5代生长旺盛的成骨细胞，胰蛋白酶消化后，以107/ml的浓度封入冻存管进行超低温冻存，一个月后复苏，以106/ml的浓度接种在含有5mlDMEM培养液的培养瓶中培养。每种方法培养的细胞每日在相差显微镜下观察细胞的形态，通过Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶染色，vonKossa法进行钙结节染色，观察细胞体外基质分泌和骨化过程。 结果：骨膜培养第3天可见少量的梭形细胞从组织块周围游出，随培养时间延长细胞数量逐渐增多，围绕组织块周围呈放射状生长，10天时细胞融合成单层。传代后的细胞呈梭形、多角形，带有粗大的突起，4天时融合成单层。组织块培养的原代和传代细胞均有活跃的增殖能力，碱性磷酸酶染色及钙结节染色阳性。骨髓培养刚接种时细胞呈球形悬浮于培养液中，4～5天时贴壁细胞开始增殖呈克隆样生长，10～12天细胞长满瓶底。细胞传代后5天汇合成单层，细胞增殖旺盛，骨髓培养的原代细胞碱性磷酸酶染色阳性率低于传代后细胞的阳性率。传代细胞碱性磷酸酶染色阳性率高，钙结节染色呈阳性。 结论：两种来源的细胞均表现典型成骨细胞的形态特征和较强的生物学活性，均可作为骨组织工程种子细胞的可靠来源。细胞冻存复苏后形态特征和生物学活性变化不大，可作为保存细胞的一种方法。 目的观察成骨细胞同种异体移植的成骨情况及免疫反应，比较冻存成骨细胞和未冻存细胞在成骨能力和免疫原性方面的差异，探讨同种异体成骨细胞移植的可行性，为进一步的研究奠定基础。 方法取新生新西兰大白兔胫骨骨髓，分离后加入条件培养液体外培养原代成骨细胞，细胞传代后，对细胞进行形态学、碱性磷酸酶(ALP)染色及体外矿化能力的检测。取第5代生长旺盛的细胞一部分进行动物体内试验，另一部分采用超低温冻存的方法保存，1个月后复苏，取复苏后生长旺盛的细胞进行动物实验，与未冻存细胞在成骨情况、免疫反应方面进行比较。将冻存和未冻存的两种细胞以2×107/ml浓度分别与磷酸三钙(TCP)复合，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，3天后用于植入动物实验。30只新西兰大白兔为移植受体，随机分为A、B、C三组，将两种复合体和单纯TCP材料分别植入到兔腹直肌肌袋内，每组10只，共三组，A组(冻存细胞组)、B组(未冻存细胞组)、C组(单纯材料组)。术后第1、2、4、8、12周分别取标本进行组织学观察、血清特异性抗体检测、淋巴细胞增殖试验和淋巴细胞毒试验。 结果实验组各兔移植术后无一例发生感染，切口均为一期愈合，未见明显全身及局部排斥反应，A、B两组移植后第2、4周检测到特异性抗体，8周时已检测不到特异性抗体，细胞介导的细胞毒反应和淋巴细胞增殖反应于术后2周开始检测到，4周达峰值，8周时开始消退，HE染色见大量的炎细胞浸润，8周时已有成骨现象。A、B两组在第2、4周检测指标出现明显差异，8周以后逐渐减弱。C组移植术后在各时间点未见明显的体液及细胞免疫反应。 结论成骨细胞复合TCP同种异体移植后成骨能力肯定，冻存和未冻存成骨细胞异体移植后成骨情况无明显差异，细胞经超低温冻存后免疫原性明显降低，单纯TCP材料未见明显的免疫反应。 收起