摘要: 本文研究目的：运用甲基化特异性PCR方法检测肝细胞癌组织及癌旁组织中OPCML、p15、SOCS-1、GST-p、RAR-b、p16、p73、p14、MGMT并口hMLH1基因的甲基化状况，旨在探讨肝癌中是否也存在CpG岛甲基化表型，以及CpG岛甲基化表型和OPCML基因与肝癌的发生和... 展开 本文研究目的：运用甲基化特异性PCR方法检测肝细胞癌组织及癌旁组织中OPCML、p15、SOCS-1、GST-p、RAR-b、p16、p73、p14、MGMT并口hMLH1基因的甲基化状况，旨在探讨肝癌中是否也存在CpG岛甲基化表型，以及CpG岛甲基化表型和OPCML基因与肝癌的发生和预后是否有关。 材料收集：1998年11月～2003年11月年中山大学肿瘤防治中心肝胆外科手术切除的标本。其中合并门静脉主干或一级分支癌栓的病例23例，并随机选择同期未合并门静脉主干或一级分支癌栓的病例27例，共50例肿瘤样本，相应的癌旁组织48例。 研究方法： 1.本研究利用甲基化特异性PCR(MS-PCR)技术检测肝癌及其癌旁组织中OPCML，MGMT，RAR-b，hMLH1，GST-p，p14，p15，p16，p73，SOCS-1等10个基因的甲基化情况。 DNA亚硫酸修饰：按照Herman(10)介绍的方法进行DNA亚硫酸修饰。2μgDNA溶于50μl水中，加入NaOH(终末浓度为0.2mol/L)，37℃变性10min；然后加入30μl10mmol/L的氢醌和520μl3mol/L的亚硫酸氢钠(pH5.0)，混匀后加矿物油于50C孵育16h。应用WizardDNA纯化柱纯化修饰DNA；纯化后的DNA再用NaOH(终末浓度未0.3mol/L)于室温下处理5min，乙醇沉淀，回收沉淀的DNA溶于50μl水中-80℃储存备用。每轮PCR反应需2μl修饰的DNA做模板。 MSP：特异性CpG甲基化状态运用MSP方法(DNA经过亚硫酸修饰，设计特异性扩增甲基化和非甲基化DNA序列的引物)来检测。亚硫酸处理DNA，能使所有的未甲基化胞嘧啶转变成尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶)因对此处理无效而仍为胞嘧啶。因此，经过处理以后，甲基化与非甲基化的DNA具有不同的序列。从而根据甲基化和非甲基化DNA单链序列的差异来设计不同的PCR引物。通过PCR扩增甲基化或非甲基化DNA单链及对PCR产物进行琼脂糖电泳即可以判断所取标本的基因甲基化状态。p14，p15，p16，p73，MGMT，OPCML，SOCS-1，RAR-b，GST-pandhMLH1的甲基化状态运用MSP(10)方法来检测。 2.病例入选标准：1998年-2003年我院肝胆科手术切除标本；由我院病理确诊为HCC病例；随访资料完整； 3.实验分组：肝癌组50例(癌栓组23例，无癌栓组27例)，对应癌旁肿瘤组织：48例 研究结果：肝癌组织甲基化率普遍比相应癌旁组织甲基化率高：OPCML(70.0％vs64.6％)、p15(58.0％vs50.0％)、SOCS-1(78.0％vs50.0％)、GST-p(56.0％vs27.1％)、RAR-b(30.0％vs6.3％)、p16(26.0％vs14.6％)、p73(16.0％vs0％)、p14(36.0vs27.1％)、MGMT(16.0％vs10.4％)和hMLH1(18.0％vs4.2％)。SOCS-1，GST-p，RAR-b，p16和p73基因甲基化率在肝癌组与癌旁组差异有显著性(P＜0.05)，其它基因两组之间的甲基化率差异无显著性。CIMP阳性组(同时具有≥3个位点甲基化)复发时间较早，一年无瘤生存率为18.2％，而CIMP阴性组(具有≤2个位点甲基化)复发时间较晚，一年无瘤生存率为75.0％(P＜0.05)。p15、p73、hMLH1、MGMT、RAR-b、GST-p、SOCS-1基因在癌栓组中的甲基化率比无癌栓组高，但未发现具有统计学意义(P＞0.05)。 研究结论：肝癌中也存在着CpG岛甲基化表型(CIMP)，CIMP可作为肝癌患者预后判断的指标之一；OPCML基因甲基化可能在肝癌的发生中发挥着重要的作用。 收起