摘要: 维持较高的K<'+>/Na<'+>比是植物抵抗盐胁迫的主要方式之一。生理研究表明，在盐胁迫下，獐茅能维持较高的K<'+>/Na<'+>比，本研究期望从獐茅中获得一种K<'+>转运蛋白，在盐胁迫下，能够高亲和性地吸收K<'+>，既保证植物的钾素营养，又维持K<'+>/Na<'... 展开 维持较高的K<'+>/Na<'+>比是植物抵抗盐胁迫的主要方式之一。生理研究表明，在盐胁迫下，獐茅能维持较高的K<'+>/Na<'+>比，本研究期望从獐茅中获得一种K<'+>转运蛋白，在盐胁迫下，能够高亲和性地吸收K<'+>，既保证植物的钾素营养，又维持K<'+>/Na<'+>比平衡，进一步研究其在提高植物耐盐能力中的作用。 通过已知高亲和性K<'+>转运蛋白基因序列设计一对简并引物，利用RT-PCR和RLM-RACE技术获得了獐茅HAK基因的cDNA全序列，命名为AlHAK。AlHAK的cDNA全长2884 bp，5′端非编码区300 bp，3′端非编码区253 bp，开放阅读框2331个核苷酸，编码776个氨基酸。氨基酸序列与芦苇(Phragmites australis)、大麦(Hordeumvulgare)、水稻(Oryzasativa)HAK的同源性分别达到了90％、83％、82％。 根据AlHAK基因全长序列设计引物扩增其编码区，并将其到酵母表达载体pYES上，转入高亲和性K<'+>吸收缺陷型酵母W△3(MATa，ade2，ura3，trp1，trk1::LEU2，trk2::HIS3)中，得到W△3-HAK。进行酵母功能互补实验，W△3-HAK能在微摩尔级K<'+>浓度下生长，其K<,m>为8±0.8 μM，但其生长被Rb<'+>和Cs<'+>的抑制，并且培养基pH<4时，对W△3-HAK生长的影响小，表明AlHAK是一种高亲和性K<'+>转运蛋白；并且W△3-HAK对300 mM Na<'+>不敏感。 将AlHAK编码区构建到表达载体pBI121上，冻融法将pBI121-HAK导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中，农杆菌介导法将AlHAK基因导入烟草(Nictianatabacum L.cv.89)。PCR、Southern杂交及RT-PCR表明外源AlHAK已整合到烟草基因组中，并在烟草中表达。生理检测表明，转AlHAK基因烟草的钾营养和耐盐性都有一定提高：在微摩尔K<'+>条件下，转基因烟草的K<'+>含量是未转化烟草的2倍；转AlHAK基因烟草在含200 mmol/L以上NaCl的培养基中依然能生根，而对照在200 mmol/L NaCl时便不生根；盐胁迫下，转基因烟草能维持根和叶中较高的K<'+>含量，较低的Na<'+>含量，并维持相对较高的K<'+>/Na<'+>比；其净光合速率(Pn)，气孔导度(Gs)，细胞间隙CO<,2>浓度(Ci)，蒸腾速率(E)比未转化烟草高；游离脯氨酸含量，可溶性糖含量均比未转化烟草高，并维持了相对较高的渗透压和相对含水量；转AlHAK基因烟草的超氧化物歧化酶(SOD)活性比未转化烟草高，而相对电导率较低。这是通过转化植物高亲合钾转运蛋白基因来提高植物耐盐性的国内外首篇研究报道。 收起