摘要: 自人类有栽培活动以来植物病害就是制约农业发展的一大因素。植物病害造成粮食大量减产的同时还影响农产品的品质。化学防治是目前农业上最主要且应用面积最大的防治措施。虽然化学防治具有方便、快速、适用面积大等优点，但也存在诸多的不足之处，如... 展开 自人类有栽培活动以来植物病害就是制约农业发展的一大因素。植物病害造成粮食大量减产的同时还影响农产品的品质。化学防治是目前农业上最主要且应用面积最大的防治措施。虽然化学防治具有方便、快速、适用面积大等优点，但也存在诸多的不足之处，如有害生物随化学农药的施用产生抗药性，导致化学农药的防治效果下降；在杀死有害生物的同时也杀死有益生物，破坏生态平衡，导致有害生物猖獗。然而，传统育种手段在选育抗病害新品种上耗时费力，远不能满足农业生产上的需求。通过遗传转化的手段将某些抗病基因或抗菌蛋白基因转化到植物中，可以很好的提高植物抗病性。目前抗菌蛋白的抗病机理有几种解释，但具体机制仍不是很清楚。 本研究以中药材补骨脂为材料，在前期工作中分离到一个具有胰蛋白酶抑制剂活性的抗菌蛋白。在克隆到编码该蛋白的基因PscAFP后，将其在毕赤酵母中表达并初步测定了蛋白PscAFP活性，同时将基因PscAFP转化到美国烟草中，对转基因烟草进行了抗病性检测。结果证明转基因PscAFP的烟草抗病能力与野生型相比明显的增强。上述实验的主要结果有： 1.将编码成熟的PscAFP蛋白的基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中；重组质粒pPIC9K-PscAFP经线性化后，用电转化法导入毕赤酵母(P.pastoris)菌株GS115(his-/mut+)中。转化子用含1.75 mg/mL G418的YPD平板筛选获得多拷贝Mut+转化子。最后，1％甲醇诱导表达出分子量约为20KDa的PscAFP蛋白。以重组PscAFP蛋白作抗原免疫家兔获得滴度达到1:512000的多克隆抗体10.9ml(浓度为0.635mg/ml)；同时，酵母表达产物PscAFP对烟草赤星病菌孢子萌发有明显的抑制作用。 2.以Phe.Val.Arg.PNA，Boc.Gly.Pro.PNA，BNPNA为胰蛋白酶水解底物表明：重组蛋白PscAFP对胰蛋白酶活性有明显的抑制作用，其抑制活力分别为15.83、11.06、1.43nmol/s/ml，而胰蛋白酶不能降解BANA，其抑制活力也就为0。 3.成功构建植物表达载体Ps-PscAFP，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导对烟草外植体进行遗传转化并获得了转基因再生植株。通过对转基因再生植株离体叶片接种烟草赤星病菌(Alternaria alternata)的实验筛选得到了抗病能力比野生型有明显提升的转基因株系。通过转基因烟草活体接种烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的实验，发现16号株系抗病能力与野生型相比有明显的提升，其病情指数为8.3％，比野生型病情指数(70.8％)下降62.5％。 收起