摘要: 研究目的：本课题旨在应用中药葛根素、粉防己碱及西药反应停作用于大鼠慢性阻塞性肺疾病模型，通过研究其对COPD大鼠的支气管厚度、支气管粘膜下炎症细胞浸润、成纤维细胞等肺组织病理学变化和羟脯胺酸、肿瘤坏死因子-a、转化生长因子-β1、SOD、ET-1... 展开 研究目的：本课题旨在应用中药葛根素、粉防己碱及西药反应停作用于大鼠慢性阻塞性肺疾病模型，通过研究其对COPD大鼠的支气管厚度、支气管粘膜下炎症细胞浸润、成纤维细胞等肺组织病理学变化和羟脯胺酸、肿瘤坏死因子-a、转化生长因子-β1、SOD、ET-1等指标，评价该三种药物对COPD大鼠气道重塑的作用并探讨其作用机制，为中医中药在COPD的-临床应用提供理论依据。 研究方法：由南京市鼓楼医院动物房提供清洁级大鼠110只，雌雄不拘，体重200±20g。随机分为：正常对照组(I)、COPD疾病模型对照组(Ⅱ)按照中医证型分为阴虚组、气虚组和血瘀组Ⅲ：COPD疾病模型(气虚证)+中药治疗组(粉防己碱为Ⅲ<,T>、葛根素为Ⅲ<,P>)；Ⅳ：COPD疾病模型(阴虚证)+中药治疗组(粉防己碱为Ⅳ<,T>，、葛根素为Ⅳ<,p>)；Ⅴ：COPD疾病模型(血瘀证)+中药治疗组(粉防己碱为Ⅴ<,T>、葛根素为Ⅴ<,p>)：Ⅵ：COPD疾病模型+反应停组(即Ⅵ<,th>组)。 由烟熏及气道滴入LPS两次，复制慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，造模用时4周。用ELISA法测定肺泡灌洗液血清ET-1、TNF-α，肺泡灌洗液中IL-8的含量，生化法分别测定血清和支气管肺组织羟脯胺酸含量，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。取大鼠右下肺置于中性福尔马林液中固定12小时以上，石蜡包埋、切片，常规HE染色，显微镜下在病理图像分析仪上观测支气管粘膜下炎症细胞浸润、成纤维细胞数等情况，100μm-200μm的支气管平滑肌厚度，以及100μm-200μm的肺小动脉血管壁厚度。用ELISA法测定人肺纤维细胞上清液的TGF-β1表达，用免疫细胞荧光化学法测定NF-KB的活性。 结果： 1、葛根素组： (1)模型组的大鼠血清TNF-α(99.2±1 5.3 pg/ml)、ET-1(9.1 6±1.93pg/ml)、肺泡盥洗液IL-8含量(115.4±2 3.8 pg/ml)明显高于正常组TNF-α(56.7±8.3 pg/ml)、ET-1(3.66±1.35 pg/ml)、IL-8(41.2±11.0 pg/ml)有显著差异，P<0.01；模型组大鼠肺组织匀浆SOD含量为(102.58±15.38kμ/g)，低于正常组(196.19±8.86k μ/g)有显著差异，P<0.01；模型组的大鼠细支气管粘膜下炎症细胞数114.2±18.7个/3个视野，明显多于对照组19.2±3.6个/3个视野有明显差异，P<0.01；模型组的支气管平滑肌厚度25.76±1.38μm，与正常组17.27±2.28μm相比明显增厚，有显著差异，P<0.01；模型组的肺小动脉壁厚度88.93±6.63μm，与正常组59.00±11.16μm相比，明显增厚，有显著差异，P<0.01。 (2)葛根素治疗组血清ET-1、TNF-α以及肺泡灌洗液IL-8含量均较模型组明显降低，差异有显著性，P<0.05(血瘀治疗组的ET-1含量明显低于模型组含量，但无统计学差异，P>0.05)；葛根素治疗组肺组织匀浆SOD值较模型组明显增高，差异有显著性，P<0.05；各治疗组的粘膜下炎症细胞数、支气管平滑肌厚度等病理学指标较模型组都有明显改善，差异有显著性，P<0.01，各治疗组肺小动脉壁厚度较模型组有明显改善，P<0.05。葛根素气虚组、阴虚组、血瘀组之间相比，差别无显著性，P>0.05。 2、粉防己碱组： (1)辛莫型组肺泡灌洗液TNF-α(33.92±8.67pg/ml)、血清HYP(13.82±1.15μg/ml)、支气管肺组织HYP(747.3±1 02.9μg/g)与正常组的TNF-α(11.1 2±5.63pg/ml)、血清HYP(7.71±1.18 μg/ml)、支气管肺组织HYP(454.0±86.5μg/g)相比有显著差异，P<0.01。模型组大鼠的细支气管粘膜下炎症细胞计数129.7±21.0个/3个视野、成纤维细胞计数18.9±1.9个/3个视野，与正常组大鼠细支气管粘膜下炎症细胞数25.0±4.7个/3个视野、成纤维细胞数9.8±1.2个/3个视野相比有明显差异，P<0.01。模型组支气管平滑肌厚度54.4±7.8μm，与正常组27.2±1.8μm相比，有显著差异，P<0.01。模型组支气管粘膜上皮TGF-β1相对含量0.457±0.047，与正常组0.213±0.034相比有显著差异，P<0.01。 (2)各治疗组(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)TNF-α含量明显低于模型组含量，有差异性，P<0.05。各治疗组血清及支气管肺组织的HYP含量、细支气管粘膜下炎症细胞及成纤维细胞计数、支气管平滑肌厚度明显小于模型组支气管平滑肌厚度、支气管粘膜上皮TGF-β1相对含量均明显低于模型组，有显著差异性，P<0.01。(3)各治疗组(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、)之间的各项指标两两对比，都未见有明显差异，P>0.05。 3、反应停组：反应停组的TNF-α含量、支气管肺组织的HYP含量、细支气管粘膜下炎症细胞计数、成纤维细胞计数、支气管平滑肌厚度、支气管粘膜上皮TGF-β1相对含量明显低于模型组，有差异性，P<0.05。 4、体外试验提示，粉防己碱能明显减轻TGF-β1在人肺纤维细胞中的表达，并随浓度增加作用而加强，P<0.05；随着时间延长，也逐渐减少，但统计学上无差异，P>0.05。人肺纤维细胞的NF-K B经Tet处理后其免疫细胞化学显色及活性明显减少。但葛根素组上述结果不明显，P>0.05。 结论： 1、血瘀是COPD的主要病机之一，治疗上采用活血化瘀法；葛根素属活血化瘀中药，符合中医理论和临床实践，故治疗COPD疗效确切。本实验中TNF-α、IL-8、ET-1、SOD、支气管粘膜下炎症细胞数、支气管及肺小动脉厚度检测中各个治疗组的指标(除血瘀组的ET-1外)均与模型组有显著差异，表明葛根素对COPD大鼠模型具有抗炎、抗氧化的作用，能够减缓COPD患者的气道重塑，延缓或阻止COPD疾病的发展，对各证型没有选择性，对抑制人肺纤维细胞的转化生长因子的表达及NF-KB作用不明显。 2、COPD发生发生过程中，可形成肺气亏虚，痰饮内停、心脉瘀阻的病机。粉防己碱中医临床应用证明有祛湿利水化饮作用，并能扩张血管，治疗COPD疗效确切，符合中医理论和临床实践。本实验中TNF-α、HYP、细支气管粘膜下炎症细胞计数、成纤维细胞、支气管平滑肌厚度、支气管粘膜上皮TGF-β1相对含量等测定均明显小于模型组，有显著差异性，证实粉防己碱对COPD模型有明显的抗炎作用，能够缓解COPD大鼠的气道重塑，延缓COPD疾病的发展，对各证型之间没有选择性；并可降低人肺成纤维细胞的转化生长因子的表达，抑制NF-KB的炎性活性，说明该药对气道重塑的作用是多途经的。 3、反应停对COPD模型也有明显的抗炎、抗气道重塑的作用，可延缓COPD的发生，发展，与粉防己碱作用相似，但后者抗重塑作用似比前者更具有优势。 4、葛根素、粉防己碱具有抗气道重塑，抗炎症、抗氧化等作用，有进一步基础与监床应用研究的价值。 收起