摘要 :
可溶性糖含量是果实品质的核心，不仅直接影响果实的风味品质，还是果实其它品质物质的合成前体。果实细胞中糖的积累能力主要受液泡膜定位的糖转运蛋白调控。Tonoplast sugar transporter(TST)、early response to dehydration six like transporter...
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可溶性糖含量是果实品质的核心，不仅直接影响果实的风味品质，还是果实其它品质物质的合成前体。果实细胞中糖的积累能力主要受液泡膜定位的糖转运蛋白调控。Tonoplast sugar transporter(TST)、early response to dehydration six like transporter(ERDL6)和vacuolar glucose transporter(VGT)是编码液泡膜糖转运蛋白的主要基因，为探明它们在苹果果实糖积累过程中的功能，本论文系统研究了表达与苹果果实糖含量相关的液泡膜葡萄糖外排蛋白ERDL6同源基因MdERDL6-1在苹果糖积累中的功能，解析了其通过调控液泡膜糖内吸蛋白TST1/2影响糖含量的机制，形成了‘MdERDL6-Glc-MdSnRK2.3-MdAREB1-MdTST1/2’调控液泡糖积累的通路。主要研究结果如下：
1.MdERDL6-1通过改变TST1/2的表达促进糖在果实中的积累。在苹果新基因组中鉴定到11个ERDL6s、6个TSTs和3个VGTs，其中MdERDL6-1在果实中高度表达，表达模式与液泡膜糖内吸蛋白MdTST1/2以及果实发育时期的糖含量积累显著正相关。分析发现，MdERDL6-1定位于液泡膜，对葡萄糖有较高的转运活性，是一个液泡膜葡萄糖外排蛋白。在苹果愈伤组织中沉默MdERDL6-1的表达，葡萄糖含量显著增加，但过表达MdERDL6-1反而显著增加了葡萄糖、果糖和蔗糖含量。同时，MdERDL6-1在苹果和番茄中的过表达增加了液泡中Glc外排，但也显著增加了苹果叶片、番茄果实中的糖含量。利用转录组分析发现，过表达MdERDL6-1转基因株系中糖含量的增加可能与TST1/2的表达显著上调有关。进一步研究证实，MdERDL6-1过表达可显著增加MdTST1/2基因表达及其编码蛋白的积累，且证实MdTST1/2表达受Glc和MdERDL6-1表达的诱导。利用VIGS技术沉默MdERDL6-1转基因番茄果实中SlTST1/2的表达，抑制了转基因番茄果实的糖含量增加。这些结果表明，MdERDL6-1介导的葡萄糖外排可通过调控TST1/2的表达促进糖在果实中的高度积累，两类液泡膜糖转运蛋白在介导液泡中糖的积累过程中存在协同作用。
2.MdERDL6-1通过转录因子MdAREB1.1/1.2调控MdTST1/2的表达促进果实糖积累。结合过表达MdERDL6-1转基因苹果转录组数据及MdTST1/2启动子顺式作用元件分析，筛选出转录因子MdAREB1.1/1.2可能调控MdTST1/2表达。经酵母单杂、LUC/REN和ChIP-qPCR等实验证明，MdAREB1.1/1.2能结合到MdTST1/2启动子上并正调控MdTST1/2的转录。在苹果愈伤组织和苹果果实中过表达MdAREB1.1/1.2，显著上调了MdTST1/2表达，增加了果糖、葡萄糖和蔗糖含量，而沉默MdAREB1.1/1.2的转基因株系，MdTST1/2表达下调，糖含量显著降低。同时，当沉默MdERDL6-1转基因苹果中MdAREB1.1/1.2的表达时，转基因株系中的MdTST1/2显著下调，糖含量降低。在番茄中，也证实MdAREB1.1/1.2同源基因SlAREB1.2受MdERDL6-1过表达的调控，影响着SlTST1/2表达和糖的积累。这些结果表明，过表达MdERDL6-1转基因苹果中MdTST1/2表达的上调与转录因子MdAREB1.1/1.2有关。
3.MdERDL6-1通过调控蛋白激酶MdSnRK2.3表达影响MdAREB1.1/1.2磷酸化水平及其对MdTST1/2的转录激活能力，从而调控着液泡中糖的积累能力。对苹果果实发育过程中MdAREB1.1/1.2的转录和蛋白水平分析发现，其转录水平和蛋白水平不一致，受到翻译后修饰。基于植物中存在保守的SnRK2-AREB1模块，在MdERDL6-1转基因苹果转录组中发现了3个上调表达的MdSnRK2家族基因，酵母双杂等实验证实MdAREB1.1/1.2与MdSnRK2.3蛋白互作，而与MdSnRK2.1/2.5不互作，同时MdSnRK2.3能够磷酸化MdAREB1.1/1.2氨基酸序列第21位的丝氨酸位点，促进MdAREB1.1/1.2对MdTST1/2的转录激活能力。在苹果果实中过表达MdSnRK2.3，增加了MdAREB1.1/1.2磷酸化水平，上调了MdAREB1.1/1.2和MdTST1/2表达，促进糖积累，且在MdERDL6-1转基因苹果中沉默MdSnRK2.3时，降低了MdAREB1.1/1.2磷酸化水平，下调了MdAREB1.1/1.2和MdTST1/2表达，降低了糖含量。在番茄中，也证实MdSnRK2.3同源基因SlSnRK2.3受MdERDL6-1过表达的调控，影响着SlTST1/2表达和糖的积累。此外，MdAREB1.1/1.2具有自身转录调控能力。上述研究结果表明，MdERDL6-1通过MdSnRK2.3磷酸化MdAREB1.1/1.2影响MdTST1/2表达和糖的积累，证实了‘MdERDL6-Glucose-MdSnRK2.3-MdAREB1.1/1.2-MdTST1/2’通路在苹果糖积累中的重要作用。
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