摘要: 抗坏血酸(Ascorbicacid,Asc)是植物和人类所需的重要抗氧化剂，在多种生理过程中起着重要作用。了解果树中Asc水平的调控对于提高果实品质及植株抗逆性具有重要意义。在前期的研究中，课题组发现F-box蛋白抗坏血酸甘露糖途径调节剂1(AscorbicAcidMann... 展开 抗坏血酸(Ascorbicacid,Asc)是植物和人类所需的重要抗氧化剂，在多种生理过程中起着重要作用。了解果树中Asc水平的调控对于提高果实品质及植株抗逆性具有重要意义。在前期的研究中，课题组发现F-box蛋白抗坏血酸甘露糖途径调节剂1(AscorbicAcidMannosepathwayRegulator1Like1)MdAMR1L1的转录水平和蛋白质丰度与苹果(Malus×domestica)果实中的Asc含量负相关。本文以MdAMR1L1转基因苹果苗为材料，从MdAMR1L1、Asc合成酶GDP-甘露糖焦磷酸化酶MdGMP1和乙烯响应因子MdERF98间的相互关系及其在Asc合成中的功能开展MdAMR1L1调控苹果Asc含量的机制研究，旨在阐明参与Asc含量调节的内部信号感知/转导的分子机理，丰富Asc合成调控的理论基础，为改善苹果果实中Asc含量及提升果实品质提供理论指导。主要研究结果如下： 1.F-box蛋白MdAMR1L1泛素化降解MdGMP1蛋白在翻译后水平上调控苹果Asc的合成。对MdAMR1L1转基因苹果叶片中Asc合成和再生的研究表明，MdAMR1L1基因表达与苹果Asc含量负相关，过表达MdAMR1L1降低了Asc含量，但促进了L-Gal(L-半乳糖)合成途径关键基因的转录，尤其是MdGMP1，对再生途径中基因的表达无显著影响，这与课题组之前的研究结果相同。为进一步探明MdAMR1L调控机制，通过IP-MS/MS技术发现MdGMP1蛋白可能与其互作。MdGMP1蛋白表达丰度研究发现，在苹果果实发育过程中MdGMP1蛋白丰度及酶活性与Asc含量相关。与野生型相比，过表达MdAMR1L1降低了苹果叶片中GMP酶活性及其催化产物GDP-D-甘露糖(GDP-D-Man)的含量，而沉默MdAMR1L1则对其有促进作用，且MdGMP1在苹果愈伤组织中的过表达能明显增加Asc含量，这些结果表明MdAMR1L1转基因苹果Asc含量与MdGMP1蛋白丰度相关。酵母双杂交和免疫共沉淀共同证实MdAMR1L1蛋白和MdGMP1蛋白互作。蛋白泛素化及降解实验表明，MdAMR1L1通过泛素化途径促进MdGMP1蛋白降解。综上所述，苹果F-box蛋白MdAMR1L1与MdGMP1蛋白互作，并通过泛素化途径促进其降解从而在翻译后水平上负调控Asc的合成。 2.转录因子MdERF98正调控MdGMP1的转录并参与苹果Asc的合成。为探明过表达MdAMR1L1苹果叶片中MdGMP1mRNA水平显著上调的机制，经转录分析发现MdGMP1候选调控因子MdERF98转录水平也显著上调。顺式作用元件预测结果显示，MdGMP1启动子包含一个ERF结合的DRE核心序列(ACCGAC)。经EMSA、LUC/REN、CHIP-PCR等实验证实转录因子MdERF98能直接与MdGMP1启动子结合并正向调控其转录。过表达MdERF98提高了苹果愈伤组织中MdGMP1和GDP-甘露糖-3''，5''-表型异构酶(MdGME1)的转录以及Asc含量，而沉默MdERF98则产生相反的结果。将野生型和MdAMR1L1过表达苹果组培苗中的MdERF98基因进行沉默后发现，MdERF98基因的沉默导致MdGMP1和MdGME1转录下调，且MdAMR1L1过表达苹果叶片中Asc含量进一步降低。这些结果表明，MdERF98正向调控MdGMP1和MdGME1的表达，且MdAMR1L1过表达苹果叶片中MdGMP1转录上调与MdERF98表达上调有关，也由此减轻了MdAMR1L1过表达引起的Asc含量的降低。 3.MdERF98参与了Asc合成的反馈调控。为了确认MdAMR1L1过表达苹果叶片中的MdERF98转录增加的原因，我们发现外源Asc能显著抑制MdERF98基因的表达及启动子的活性，且MdAMR1L1过表达转基因苹果叶片用外源Asc处理能恢复MdERF98和MdGMP1的表达，为此我们提出MdERF98可能参与了Asc合成的反馈调控。为验证这一假说，我们获得了Asc合成关键酶MdGalDH(L-半乳糖脱氢酶)过表达和沉默的转基因苹果愈伤组织，发现过表达MdGalDH提高了果肉愈伤组织中Asc含量，抑制了MdERF98的转录及其启动子活性；沉默MdGalDH降低了果肉愈伤组织中Asc含量，促进了MdERF98的转录。转基因愈伤组织中MdGMP1转录水平的变化与MdERF98相似。这些结果进一步证实MdERF98的表达受Asc水平的反馈调节，参与了Asc合成的反馈调控，在维持苹果细胞中Asc含量的稳态中起作用。过表达MdAMR1L1引起苹果叶片中H2O2含量的增加，外源Asc喷施降低H2O2含量，MdERF98表达水平上的变化与之相似。同时，H2O2诱导剂甲基紫精(MV)处理降低了苹果叶片中Asc含量却促进了MdERF98和MdGMP1的转录。这些结果表明，MdAMR1L1过表达转基因苹果叶片中MdERF98和MdGMP1基因表达的上调与H2O2积累相关。 4.bHLH型转录因子MdMYC2L-6900负调控MdGMP1的转录参与光调节苹果Asc的合成。过表达MdAMR1L1导致苹果叶片中多个bHLH型转录因子表达上调，其中包含MdMYC2L-6900，属于MYC2(茉莉酸信号通路中的关键调控因子)的同源基因。顺式作用元件预测结果显示，MdERF98和MdGMP1启动子均包含MYC2结合的G-box核心序列(CACGTN)。互作实验结果表明，MdMYC2L-6900与MdERF98的启动子不结合，而直接与MdGMP1启动子结合并抑制其转录活性。同时，我们发现MdMYC2L-6900的表达受光抑制且与Asc水平负相关。过表达MdMYC2L-6900降低了苹果叶片中MdGMP1的转录及Asc含量，而沉默MdMYC2L-6900则对其无显著影响。H2O2诱导剂MV处理MdMYC2L-6900转基因苹果株系的实验结果显示，ROS积累抑制MdMYC2L-6900的表达而促进MdGMP1的表达，且MV处理进一步降低了MdMYC2L-6900过表达株系Asc的含量，但是对MdMYC2L-6900沉默株系Asc的含量及MdGMP1的表达无显著影响。以上结果表明，bHLH型转录因子MdMYC2L-6900通过负调控MdGMP1的转录参与光调节苹果Asc的合成，但苹果中可能存在MYC基因家族成员的功能冗余。 收起