中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 章萌山东大学 2020年博士导师: 张运共334页

摘要 : 本文从以下几个方面进行论述：论文Ⅰ 促红细胞生成素诱导小鼠发生腹主动脉瘤的作用及分子机制研究研究目的： 1.探讨EPO是否可在ApoE-/-小鼠和野生型小鼠中导致AAA的产生及其剂量效应; 2.探讨EPO对小鼠AAA的影响是否受高脂喂养... 展开本文从以下几个方面进行论述：论文Ⅰ 促红细胞生成素诱导小鼠发生腹主动脉瘤的作用及分子机制研究研究目的： 1.探讨EPO是否可在ApoE-/-小鼠和野生型小鼠中导致AAA的产生及其剂量效应; 2.探讨EPO对小鼠AAA的影响是否受高脂喂养和高脂血症的影响; 3.探讨EPO通过何种类型受体发挥作用对AAA产生影响; 4.探讨EPO引起小鼠AAA的病理生理机制; 5.探讨EPO对血管壁三种细胞（内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞）的作用及其机制。 6.探讨在AAA临床患者中，血清EPO与AAA的发生有无关联。研究方法： 1.动物模型的建立和分组 (1)雄性ApoE-/-小鼠60只，全程给予高脂饲料喂养，随机分为4组，每组15只;分别给予生理盐水、EPO2，500 IU/kg/day、EPO5，000 IU/kg/day和EPO10，000IU/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。 (2)雄性ApoE-/-小鼠60只，全程给予普通饲料喂养，随机分为4组，每组15只;分别给予生理盐水、EPO2，500 IU/kg/day、EPO5，000 IU/kg/day和EPO10，000IU/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。 (3)雄性野生型小鼠60只，全程给予普通饲料喂养，随机分为4组，每组15只;分别给予生理盐水、EPO2，500 IU/kg/day、EPO5，000 IU/kg/day和EPO10，000IU/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。 (4)雌性ApoE-/-小鼠30只，全程给予高脂饲料喂养，随机分为2组，每组15只;雌性野生型小鼠30只，全程给予普通饲料喂养，随机分为2组，每组15只;分别给予生理盐水和EPO5，000 IU/kg/day腹腔注射，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。 (5)雄性ApoE-/-小鼠45只，全程给予高脂饲料喂养，随机分为3组，每组15只;雄性野生型小鼠45只，全程给予普通饲料喂养，随机分为3组，每组15只;分别给予生理盐水、焦谷氨酸螺旋B表面肽(pHBSP)30 mg/kg/day和pHBSP300 mg/kg/day持续泵入，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。 (6)雄性ApoE-/-小鼠或野生型小鼠各30只，随机分为两组，每组15只;对照组给予生理盐水持续泵入，实验组给予AngⅡ(1.44 mg/kg/day)持续泵入，全程给予高脂高胆固醇喂养或普通饲料喂养，期间每天观察小鼠有无死亡情况，记录死亡数量和原因，4周后小鼠给予安乐死。 2.鼠尾血压测量应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压，测量部位为小鼠尾动脉，每只小鼠检测3次，取其平均值作为最终数值。 3.组织取材小鼠取材前饥饿6-8小时，麻醉小鼠后取材，留取全血、血清、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织和主动脉;各组织一部分放入液氮速冻，-80℃冰箱保存，一部分置于4％多聚甲醛中固定，以备后续实验。研究结果： 1.EPO剂量依赖性地诱导ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的发生腹腔注射高中低剂量EPO4周后，发现EPO剂量依赖的增加了小鼠AAA的发生率，腹主动脉直径明显增加;同时，小鼠死亡率也呈剂量依赖性增加。EPO高剂量组诱导ApoE-/-小鼠AAA发生率与AngⅡ相当，而EPO高剂量组诱导野生型小鼠AAA发生率明显高于AngⅡ。 2.EPO导致ApoE-/-小鼠和野生型小鼠腹主动脉管壁增厚弹力板断裂结果显示注射低中高剂量EPO后，动脉管壁明显增厚，弹力纤维断裂，管腔内可伴有血栓形成。 3.EPO不影响ApoE-/-小鼠和野生型小鼠血压和血脂的变化 EPO注射4周后，与对照组相比，EPO低中高剂量组血压并无显著差异;同样，EPO注射后没有影响小鼠血脂水平变化。由此推断，EPO注射4周，对小鼠的血压和血脂无显著影响。研究结论： 1.EPO剂量依赖性地促进了ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的形成，EPO导致 ApoE-/-小鼠AAA发生率与AngⅡ相当，EPO导致野生型小鼠AAA发生率明显高于AngⅡ; 2.EPO是通过(EPOR)2同型二聚体发挥作用促进AAA的形成; 3.EPO通过引起血管新生、炎症反应和胶原降解而导致AAA的形成; 4.EPO通过内皮细胞的介导诱导巨噬细胞表达炎症因子，抑制HASMC胶原分泌，促进HASMC凋亡。论文Ⅱ 促红细胞生成素在血管紧张素Ⅱ诱导腹主动脉瘤小鼠模型中的作用和机制研究研究目的： 1.探讨EPO/EPOR信号通路在AngⅡ诱导AAA过程中起到的作用; 2.探讨AngⅡ诱导野生型小鼠AAA发生率较低的原因; 3.探讨AngⅡ作用于EPO的分子机制。研究方法： 1.动物模型的建立和分组 (1)雄性ApoE-/-小鼠60只，随机分为4组:其中对照组给予生理盐水持续泵入+生理盐水尾静脉注射，AngⅡ组给予AngⅡ持续泵入+生理盐水尾静脉注射，AngⅡ+ⅡgG2a组给予AngⅡ持续泵入+IgG2a尾静脉注射，AngⅡ+EPO中和抗体组给予AngⅡ持续泵入+EPO中和抗体尾静脉注射，4周后小鼠给予安乐死。 (2)实验组为EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠，对照组为同窝ApoE-/-小鼠，同时给予AngⅡ持续泵入，4周后小鼠给予安乐死。 (3)雄性野生型小鼠30只，随机分为两组，每组15只;对照组给予生理盐水持续泵入，实验组给予AngⅡ持续泵入，全程给予普通饲料喂养，4周后小鼠给予安乐死。 2.细胞培养和分组 (1)实验分为四组:对照组（溶剂对照），AngⅡ(50μM)组，AngⅡ+替米沙坦(1μM)组，AngⅡ+PD123319（50μM）组，刺激12小时，收集细胞; (2)实验分为四组:对照组（溶剂对照），AngⅡ(50μM)组，AngⅡ+替米沙坦(1μM)组，AngⅡ+U0126(50μM)组，刺激12小时，收集细胞。 3.鼠尾血压测量在给予药物干预4周末，应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压，测量部位为小鼠尾动脉，每只小鼠检测3次，取其平均值作为最终数值。 4.组织取材步骤小鼠取材前饥饿6-8小时，麻醉小鼠后取材，留取全血、血清、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织和主动脉;各组织一部分放入液氮速冻，-80℃冰箱保存，一部分置于4％多聚甲醛中固定，以备后续实验。 5.血常规检测使用兽用全自动血液细胞分析仪检测各组小鼠全血红细胞计数，血红蛋白含量和红细胞压积。 6.免疫组织化学染色腹主动脉组织制备石蜡切片，对IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α进行免疫组织化学染色。 7.蛋白免疫印迹实验研究结果 1.EPO在AngⅡ诱导ApoE-/-小鼠发生AAA的过程中起到重要作用结果显示，AngⅡ组和AngⅡ+IgG2a组AAA发生率明显增高;AngⅡ组和AngⅡ+IgG2a组之间无显著性差异，而AngⅡ+EPO中和抗体组AAA发生率降为20％。AngⅡ+EPO中和抗体组腹主动脉直径明显降低，死亡率明显下降。 2.EPOR在AngⅡ诱导ApoE-/-小鼠发生AAA的过程中起到重要作用由于EPOR4-纯合小鼠致死，故我们只能获得EPOR+/-杂合小鼠。给予AngⅡ埋泵4周后，结果显示与ApoE-/-小鼠组相比，EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠组AAA发生率明显降低，且腹主动脉直径明显降低，死亡率降低至0。 3.EPOR敲除抑制AngⅡ诱导ApoE-/-小鼠AAA中炎症因子的表达 EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠组腹主动脉管壁IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α的表达明显少于ApoE-/-小鼠组。 4.各组小鼠血清EPO水平比较 ApoE-/-小鼠和野生型小鼠给予AngⅡ干预后，AngⅡ组的血清EPO水平比对照组高出2倍以上。同样给予AngⅡ干预的ApoE-/-小鼠的血清EPO水平显著高于野生型小鼠的血清EPO水平。在野生型小鼠中，EPO注射组导致的血清EPO水平远高于AngⅡ干预组。在AngⅡ和EPO诱导的ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA发病机制中EPO起了至关重要的作用。研究结论： 1.EPO/EPOR信号通路在AngⅡ诱导AAA过程中起到关键性作用; 2.血清EPO水平在AngⅡ和EPO诱导的ApoE-/-和野生型小鼠AAA发病机制中起到关键作用; 3.AngⅡ通过AT1 R/ERK1/2通路上调肾脏细胞和平滑肌细胞EPO表达，分别增加循环EPO水平和局部组织EPO水平。收起

关键词 : 腹主动脉瘤病理机制促红细胞生成素分子调节

2. 利钠肽受体C在调节动脉粥样硬化病变和脂肪组织炎症中的作用及机制研究

[学位论文] 成程山东大学 2021年博士导师: 张运共300页

摘要 : 本文从以下几个部分展开论述：第一部分:利钠肽受体C调控动脉粥样硬化斑块形成的实验研究研究目的： 1.探讨NPRC与小鼠动脉粥样硬化病理发生的相关性; 2.探讨NPRC是否参与调节小鼠动脉粥样硬化斑块的病变程度; 3.探讨NPRC... 展开本文从以下几个部分展开论述：第一部分:利钠肽受体C调控动脉粥样硬化斑块形成的实验研究研究目的： 1.探讨NPRC与小鼠动脉粥样硬化病理发生的相关性; 2.探讨NPRC是否参与调节小鼠动脉粥样硬化斑块的病变程度; 3.探讨NPRC是否参与调节小鼠粥样硬化斑块中的内皮细胞凋亡; 4.探讨NPRC是否参与调节小鼠粥样硬化斑块中的炎症反应。研究方法： 1.实验动物利用CRISPR-Cas9技术在C57BL/6背景小鼠上构建NPRC基因敲除(NPRC-/-)小鼠。并与载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠杂交扩繁后，得到同窝纯合ApoE-/-小鼠和纯合ApoE-/-NPRC-/-小鼠。 2.实验动物分组 (1)选取8周龄的雄性ApoE-/-小鼠20只，随机分为两组，每组10只:普食喂养组，高脂喂养组。 (2)分别选取8周龄雄性ApoE-/-小鼠和同窝雄性ApoE-/-NPRC-/-小鼠，随机分成两组，每组25只:ApoE-/-组，ApoE-/-NPRC-/-组。 3.建立动脉粥样硬化小鼠模型 4.小鼠基因型鉴定 5.体重和体长称量 6.鼠尾血压和心率测定 7.组织取材 8.血脂水平检测 9.Meso Scale Discovery(MSD)检测血清中炎症相关指标 10.血管组织中cAMP水平检测 11.血清中利钠肽水平的检测 12.血管组织全基因组测序分析 13.组织标本病理学检测 14.细胞培养和处理 15.蛋白免疫印迹实验 16.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR) 17.细胞转染 18.腹腔巨噬细胞的提取 19.巨噬细胞迁移实验 20.巨噬细胞脂质吞噬实验 21.TUNEL细胞凋亡检测 22.数据统计分析方法研究结果： 1.在高脂高胆固醇饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型主动脉组织中NPRC的表达量明显上调 2.利用ApoE-/-NPRC-/-小鼠构建高脂高胆固醇饮食诱导的小鼠动脉粥样硬化模型通过对小鼠鼠尾基因组DNA进行基因型的测序鉴定，证实了ApoE-/-NPRC-/-小鼠成功构建。同时利用Western blot和组织免疫化学染色的方法进一步验证ApoE-/-NPRC-/-小鼠主动脉组织中NPRC的蛋白敲除效率。测量2组小鼠(ApoE-/-组和ApoE-/-NPRC-/-组)造模后的体重和体长，发现NPRC基因敲除不影响小鼠的体重，但明显增加小鼠的体长。 3.结果显示造模后的ApoE-/-NPRC-/-组小鼠的血清甘油三酯水平明显低于造模后的ApoE-/-组小鼠。 4.高脂饮食喂养12周后，与ApoE-/-组小鼠相比，ApoE-/-NPRC-/-组小鼠的血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇水平无明显差异。 5.高脂饮食喂养12周后，与ApoE-/-组小鼠相比，ApoE-/-NPRC-/-组小鼠的收缩压有轻微的降低。 6.高脂饮食喂养12周后，与ApoE-/-组小鼠相比，ApoE-/-NPRC-/-组小鼠的心率、舒张压和平均动脉压的水平未见明显差异。 7.NPRC基因缺失减轻高脂饮食诱导的动脉粥样硬化病变程度 8.NPRC基因缺失影响了动脉粥样硬化斑块中的组织成分并且增加了斑块的稳定性。 9.全转录组测序结果发现，两组间的差异基因明显富集在炎症反应、白细胞募集和浸润中。 10.NPRC基因缺失减轻血清及斑块中的炎症相关分子和黏附分子的水平 11.在主动脉壁的三种细胞中内皮细胞的NPRC mRNA表达量最高 12.NPRC基因敲减上调斑块中和HUVEC中的eNOS表达水平 13.NPRC基因敲减减轻oxLDL诱导的HUVEC凋亡 14.NPRC基因敲减减轻oxLDL刺激引起HUVEC的p-AKT1水平下调 15.NPRC基因敲减减轻oxLDL刺激HUVEC炎症相关分子和黏附分子的表达 16.在oxLDL刺激下，HUVEC中敲减NPRC基因后巨噬细胞迁移能力明显下降 17.在oxLDL刺激下，HUVEC中敲减NPRC基因后能够有效抑制巨噬细胞对脂质的吞噬，进而减少泡沫细胞的形成。 18.在oxLDL刺激下，HUVEC中敲减NPRC基因后NPRC干扰组HUVEC的培养基上清能够有效抑制巨噬细胞中炎症相关分子TNFα、IL-6、MCP1的表达。 19.在oxLDL刺激下，HUVEC敲减NPRC基因抑制NF-κB信号通路的激活 20.NPRC基因缺失或敲减均激活cAMP/PKA信号通路 21.PKA通路激活上调HUVEC中eNOS和P-AKT1的表达并抑制NF-κB信号通路实验结论： 1.NPRC在发生粥样硬化斑块的主动脉病理组织中蛋白表达量升高。 2.NPRC基因缺失明显减轻了小鼠粥样硬化病变程度。 3.NPRC基因缺失缓解了粥样硬化斑块中内皮细胞的凋亡。 4.NPRC基因缺失减少了粥样硬化小鼠体内的炎症。第二部分:利钠肽受体C调节高胆固醇血症诱导的脂肪炎症的实验研究研究目的： 1.探讨NPRC与高脂血症小鼠脂肪炎症发生的相关性; 2.探讨NPRC是否参与调节高脂血症小鼠脂肪炎症的病变程度; 3.探讨NPRC是否参与调节高脂血症小鼠脂肪中巨噬细胞的浸润; 4.探讨NPRC是否参与调节高脂血症小鼠脂肪细胞的凋亡; 5.探讨NPRC是否参与调节高脂血症小鼠脂肪中的氧化应激。研究方法： 1.实验动物分组 2.高脂血症小鼠模型的建立 3.小鼠组织样本取材 4.小鼠脂肪组织制备 5.免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色 6.TUNEL细胞凋亡检测 7.组织DHE荧光染色 8.组织RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR) 9.Western blot分析 10.数据统计分析方法研究结果： 1.在高脂饮食喂养的小鼠中脂肪组织中NPRC的表达量明显上调 2.在高脂饮食喂养的小鼠中脂肪组织中巨噬细胞浸润明显增加 3.在高脂饮食喂养的小鼠中脂肪组织中凋亡细胞数明显增加 4.在高脂饮食喂养的小鼠中脂肪组织中氧化应激明显增强 5.利用ApoE-/-NPRC-/-小鼠构建高脂诱导的高脂血症小鼠模型在C57BL/6J的小鼠背景下，利用CRISPR-Cas9技术成功构建NPRC敲基因(NPRC-/-)小鼠。再用NPRC-/-小鼠和ApoE-/-小鼠杂交得到ApoE-/-NPRC-/-小鼠和同窝对照的ApoE-/-小鼠。通过对小鼠鼠尾基因组DNA进行基因型的测序鉴定，证实了ApoE-/-NPRC-/-小鼠成功构建。同时利用Western blot和组织免疫化学染色的方法进一步验证了ApoE-/-NPRC-/-小鼠脂肪组织中NPRC的蛋白敲除效率。 6.NPRC基因缺失下调高脂高胆固醇小鼠血清甘油三酯的水平 7.NPRC基因缺失不影响高脂高胆固醇小鼠血清胆固醇的变化 8.NPRC基因缺失轻微降低高脂高胆固醇小鼠收缩压的水平 9.NPRC基因缺失不影响高脂高胆固醇小鼠心率、舒张压和平均动脉压的水平。 10.NPRC基因缺失下调ApoE-/-小鼠白色脂肪的体积和重量 11.NPRC基因缺失不影响ApoE-/-小鼠棕色脂肪的体积和重量 12.NPRC基因缺失减轻ApoE-/-小鼠白色脂肪中的炎症相关因子的表达。 13.NPRC基因缺失减轻ApoE-/-小鼠白色脂肪中的巨噬细胞浸润 14.NPRC基因缺失减轻了ApoE-/-小鼠白色脂肪中的细胞凋亡 15.NPRC基因缺失减轻了ApoE-/-小鼠白色脂肪中的氧化应激 11.NPRC基因缺失下调了ApoE-/-小鼠白色脂肪中的Nlrp3炎症小体和IL-1β的表达 12.NPRC基因缺失促进了ApoE-/-小鼠白色脂肪的棕色化 13.NPRC基因缺失促进了ApoE-/-小鼠白色脂肪的脂解作用 14.NPRC基因缺失上调了ApoE-/-小鼠白色脂肪中的脂联素水平 15.NPRC基因缺失激活PKA信号通路 16.NPRC基因缺失减轻高脂血症小鼠脂肪炎症的机制实验结论： 1.NPRC参与了调控高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠的白色脂肪炎症; 2.NPRC缺失通过激活脂肪细胞中的PKA通路，增强白色脂肪的棕色化和脂解作用，上调白色脂肪的脂联素的表达，抑制炎症相关分子的表达，从而下调巨噬细胞的炎症浸润，细胞凋亡和氧自由基的产生，最终减轻了白色脂肪的炎症。收起

关键词 : 动脉粥样硬化病变病变机制利钠肽受体C 斑块形成脂肪组织炎症调控

3. 利钠肽受体C在糖尿病性心肌病发病中的作用和分子机制研究

[学位论文] 孟霖霖山东大学 2022年博士导师: 张运共292页

摘要 : 研究背景糖尿病性心肌病(diabeticcardiomyopathy,DCM)是由代谢紊乱引发的心脏疾病，其心脏结构改变包括心肌纤维化、心肌肥厚和冠脉损伤等，其中心肌纤维化是DCM的主要特征。临床试验发现，糖尿病患者血糖水平和心肌纤维化程度呈正相关，但目前... 展开研究背景糖尿病性心肌病(diabeticcardiomyopathy,DCM)是由代谢紊乱引发的心脏疾病，其心脏结构改变包括心肌纤维化、心肌肥厚和冠脉损伤等，其中心肌纤维化是DCM的主要特征。临床试验发现，糖尿病患者血糖水平和心肌纤维化程度呈正相关，但目前无直接证据表明控制血糖可改善心肌纤维化并减少心血管不良事件的发生。因此，寻找DCM发病中的关键靶点对于延缓DCM心肌纤维化的发生具有重要意义。在心力衰竭的发生和发展中，神经体液因子的激活起到了重要作用，其中研究最为广泛的两种包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统(rerin-angiotensin-aldosteronesystem，RAAS)和利钠肽（natriureticpeptide，NPs）家族。在心力衰竭的早期阶段，血流动力学的异常导致RAAS激活，作为代偿机制维持心输出量。然而，RAAS的持续激活导致心室重构，加剧心衰症状。NPs作为内源性的可拮抗RAAS激活、降低血压、降低心脏负荷的因子，在心血管系统中的作用越来越受到关注。 NPs家族主要包括3种肽链即心房利钠肽（atrialnatriureticpeptide，ANP）、脑利钠肽（brainnatriureticpeptide，BNP）、C型利钠肽(C-typenatriureticpeptide，CNP)和它们的3种受体，即NPRA、NPRB和NPRC。研究发现，NPs可结合NPRA和NPRB，通过利尿、利钠、舒张血管等作用降低血压，并可抑制心肌纤维化及病理性心室重构。然而，关于NPRC在心脏中的作用尚不明确。既往有研究发现，NPRC敲除抑制了小鼠的窦房结功能，促进了小鼠房颤的发生，也可以加重血管紧张素Ⅱ导致的心房纤维化及房颤。但也有研究发现NPRC敲除可以减轻TGF-β1以及主动脉缩窄所导致的心房纤维化。然而关于NPRC敲除对心室纤维化的影响，目前尚不明确。本实验室的一项研究结果表明，NPRC敲除可抑制白色脂肪组织的炎症水平，增强棕色化和脂解作用，说明NPRC敲除可能在脂肪代谢性疾病中起到保护作用。那么NPRC敲除能否在同样与代谢相关的DCM的左室心肌纤维化进展中起到保护作用，有待于进一步探索，这可能对研发以NPs为基础的DCM心肌纤维化的治疗方法具有重要意义。近年来，以增强NPs作用为靶点的药物逐渐成为心衰治疗的研究重点。沙库巴曲/缬沙坦（sacubitril/valsartan，Sac/val）是近年来欧洲和美国慢性心衰指南的Ⅰ级推荐药物，其中的沙库巴曲成分是脑啡肽酶(neprilysin，NEP)的抑制剂，该酶可剪切NPs导致其功能失活。Sac/val可抑制NEP，增加血清中NPs的水平，并通过缬沙坦成分发挥拮抗RAAS的作用。动物实验发现，Sac/val可改善DCM小鼠的心肌纤维化和心肌细胞凋亡，保护DCM小鼠的心功能。然而，除NEP介导的酶降解途径外，NPRC介导的受体降解途径也是体内NPs的清除途径之一。目前尚无研究对比NPRC和NEP对DCM心肌纤维化的干预效果。因此，为了明确NPRC基因缺失和Sac/val对DCM纤维化改善效果的区别，我们构建了NPRC敲除DCM小鼠和Sac/val灌胃治疗DCM小鼠模型，探讨NPRC基因缺失和Sac/val在DCM发病中的作用和机制的区别。论文Ⅰ利钠肽受体C在糖尿病性心肌病心肌纤维化中的作用及分子机制研究研究目的 1.探讨在DCM小鼠模型中，心脏组织NPRC表达水平的变化; 2.探讨NPRC能否调控小鼠DCM心肌纤维化的进展; 3.探讨NPRC调控DCM心肌纤维化进展的可能机制。研究方法 1.实验动物采用CRISPR/Cas9技术构建NPRC基因敲除小鼠，并与野生型小鼠C57BL/6J回交后，得到NPRC基因敲除小鼠(NPRC-/-)和相同遗传背景的野生型小鼠(NPRC+/+，WT)。 2.实验动物分组 (1)8周龄雄性C57BL/6J小鼠20只，随机分成两组:对照(control)组和糖尿病(diabetesmellitus，DM)组; (2)选取8周龄雄性NPRC-/-小鼠和同窝对照WT小鼠，随机分为以下4组:WT+对照组、NPRC-/-+对照组、WT+DM组、NPRC-/-+DM组。 3.小鼠DCM模型建立给予8周龄小鼠腹腔注射链脲佐菌素溶液（streptozotocin，STZ,55mg/kg/d，连续5天），对照组注射等体积缓冲液。2周后取小鼠尾静脉血测量空腹血糖，若空腹血糖水平＞16.7mmol/l则认为糖尿病模型构建成功。继续喂养小鼠，16周后给予小鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠使其安乐死。 4.小鼠超声心动图检查在糖尿病造模16周后，使用Vevo2100成像系统对小鼠进行超声心动图检查以评估左心室收缩和舒张功能。检测指标如下:左室舒张末期内径(leftventricularend-diastolicdiameter,LVEDD)、左室收缩末期内径(leftventricularend-systolicdiameter,LVESD)、左室射血分数（leftventricularejectionfraction，LVEF）、左室短轴缩短率（leftventricularfractionalshortening，LVFS）、舒张早期和舒张晚期二尖瓣血流峰值速度(E、A)、舒张早期二尖瓣瓣环速度(e'')。 5.组织取材及病理学检查糖尿病造模16周后，给予小鼠安乐死并取材。留取小鼠血清，离心后冻存于-80℃冰箱。利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清ANP、BNP和CNP的水平。拟行组织病理学检查的心脏组织置于4％多聚甲醛固定。固定后行石蜡包埋，制备石蜡组织切片，对其进行HE、Masson染色、免疫组化染色(immumohistochemicalstaining,IHC)检测CollagenⅠ、CollagenⅢ、p-VASP、p-CREB、p-PKAsubstrates、ANP、BNP和CNP的水平、免疫荧光检测NPRC的水平。拟行分子生物学检查的心脏组织放入液氮速冻，转存-80℃冰箱。 6.细胞提取和处理实验中采用组织消化和差速贴壁法提取新生大鼠乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞。心肌细胞(cardiomyocytes，CM)培养在含8％马血清和5％新生牛血清的低糖DMEM培养基中。心肌成纤维细胞（cardiacfibroblasts，CF）培养在含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中。所有细胞培养在含有5％CO2的37℃培养箱中。分别给予正常糖（normalglucose，NG）组和高糖(highglucose，HG)组的细胞终浓度为5.5mM和33.3mM的葡萄糖刺激，并给予高渗(highosmotic，HO)组细胞终浓度为33.3mM的甘露醇刺激。细胞主要处理如下: (1)分别给予CFNG、HG和HO刺激并收集细胞; (2)分别给予CF对照小干扰RNA(si-NC)和NPRC小干扰RNA(si-NPRC)转染，随后给予NG和HG刺激，收集细胞; (3)分别给予CMsi-NC和si-NPRC转染，随后给予NG和HG刺激，然后用不同处理的CM上清处理CF，收集细胞; (4)分别给予CFsi-NC、si-NPRC、si-NPRC+si-TGIF1转染，随后给予HG刺激，收集细胞; (5)分别给予CF对照腺病毒(Ad-GFP)、ANP过表达腺病毒(Ad-ANP)、BNP过表达腺病毒(Ad-BNP)和CNP过表达腺病毒(Ad-CNP)转染并收集细胞; (6)给予CFcAMP/PKA的激活剂forskolin和抑制剂H89处理并收集细胞; (7)给予CFcGMP/PKG的激活剂8-br-cGMP和抑制剂KT5823处理并收集细胞; 7.细胞免疫荧光检测对不同处理的细胞爬片行4％多聚甲醛固定、0.1％TritonX-100通透、5％BSA封闭和一抗过夜孵育，次日清洗后孵育二抗，并滴加DAPI染核，应用荧光显微镜检测荧光信号并保存。 8.细胞增殖检测实验对细胞进行处理后，向细胞培养基中以1∶2500的比例滴加EdU溶液，孵育12小时后，对细胞进行固定、通透、染色处理，检测荧光信号并保存。另外，向处理后的细胞培养基中以1∶10的比例加入CCK-8溶液，孵育4小时后，于酶标仪上读取450nm处的吸光度（OD值）。 9.免疫共沉淀(CO-IP)实验对细胞进行处理后，用裂解液裂解细胞，分别加入cPML的抗体和对照小鼠IgG孵育1小时，然后加入琼脂糖珠孵育过夜。次日用裂解液清洗琼脂糖珠，随后进行Westernblot检测。 10.细胞质和细胞核蛋白分离提取对细胞进行处理后，利用胞浆和胞核提取缓冲液分别提取细胞质和细胞核蛋白并行Westernblot检测。 11.细胞cAMP和cGMP水平检测细胞经处理后，应用CyclicAMP/GMP化学发光检测试剂盒检测细胞cAMP和cGMP水平，并在酶标仪上读取450nm的OD值。 12.细胞转录组测序细胞经处理后，用Trizol溶液反复吹打裂解细胞，将裂解液冻存于-80℃后，送往上海鲸舟基因科技有限公司进行转录组测序及分析。 13.RNA提取、反转录和实时荧光定量PCR(RT-PCR) 提取细胞总RNA，测量浓度后进行反转录获得cDNA，然后通过实时荧光PCR获取细胞中NPRA、NPRB、NPRC、TGIF1基因的Ct值，以2-ΔΔCt公式计算基因的相对表达量。 14.蛋白免疫印迹实验(Westernblot) 利用蛋白提取试剂盒提取小鼠心脏组织蛋白，或利用裂解液提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后应用半干转法将蛋白转印到膜上。膜经封闭后过夜孵育一抗，次日清洗后孵育二抗，应用化学发光法检测蛋白信号。 15.数据分析所有数据经正态性检验。符合正态分布的连续变量以均数±标准误表示。两组之间的数据比较使用非配对t检验，多组之间且只有一个变量的数据比较使用单因素方差分析，多组之间且有多个变量的数据比较使用双因素方差分析，然后进行Turkey事后检验。对所有数据，p＜0.05定义为有统计学意义。数据的分析和统计使用GraphPadPrism8软件进行。研究结果 1.DCM小鼠模型中心脏NPRC表达增加我们对16周的对照组和糖尿病组小鼠心脏中NPRC的表达水平进行了检测。Westernblot和组织免疫荧光染色的结果显示，糖尿病小鼠心脏组织中NPRC的表达水平较对照组明显升高，提示NPRC和小鼠DCM的病变相关。 2.心脏主要细胞NPRC表达量的比较我们对CM和CF中的NPRC基因表达水平进行了检测。PCR结果显示，CF的NPRCmRNA表达水平高于CM。另外，细胞免疫荧光和PCR结果均显示，CF中NPRC的分布高于NPRA和NPRB。 3.高浓度葡萄糖刺激可增加CF的NPRC表达水平 Westernblot和PCR结果显示，与NG组的CF相比，HG组CF的NPRC表达水平明显升高，但HO组CF的NPRC表达水平无明显改变。 4.利用NPRC-/-小鼠构建DCM模型 (1)我们采用CRISPR/Cas9技术构建了NPRC敲基因小鼠，通过Westernblot检测，确定了NPRC-/-小鼠心脏组织中的NPRC敲除效率。 (2)我们给8周龄NPRC-/-小鼠和同窝对照WT小鼠注射STZ构建了DC 收起

关键词 : 糖尿病性心肌病心肌纤维化 NPRC TGIF1

4. 铁调素调节动脉粥样硬化斑块稳定性的作用及相关机制研究

[学位论文] 李晶晶山东大学 2012年博士导师: 张运共273页

摘要 : 背景：动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块形成是心脑血管疾病的共同病理学基础。大量证据表明，铁在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用。在人及新西兰大白兔的动脉粥样硬化斑块处，均发现铁沉积明显增多，而在给予铁螯合剂治疗后，动脉... 展开背景：动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块形成是心脑血管疾病的共同病理学基础。大量证据表明，铁在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用。在人及新西兰大白兔的动脉粥样硬化斑块处，均发现铁沉积明显增多，而在给予铁螯合剂治疗后，动脉粥样硬化的情况有明显好转。斑块内的铁沉积总是与巨噬细胞浸润和泡沫细胞的出现密切相关。在动脉粥样硬化发生发展的过程中，铁作为一种强氧化剂，可以通过Haber-Weiss反应催化产生大量活性氧，促进细胞内脂质过氧化反应，损伤蛋白质和（或）核酸，促进巨噬细胞凋亡并释放出大量细胞内容物，这些物质可以进一步促进巨噬细胞的侵润，使脂质过氧化反应不断放大。铁调素(hepcidin，Hep)是近年发现的一种在肝脏合成并富含半胱氨酸的抗菌多肽，具有抑制肠道铁吸收和单核巨噬细胞系统铁释放的作用，是一种重要的负性铁调节激素。膜铁转运蛋白1(ferroportinl，FP1)是巨噬细胞膜上已知唯一的铁输出蛋白。Hep与巨噬细胞表面的FP1结合后，促进其内吞和降解，使巨噬细胞内的铁增多，氧化作用增强。Hep的表达受炎性因子的调节，发生炎症或感染时，一些细胞因子表达量增加促进铁调素基因表达，进而调节体内铁平衡。LPS、Interleukin-6(IL-6)、Interleukin-1（IL-1）均可促进体内Hep水平的升高。 2007年，SullivanJL等人提出了铁调素与动脉粥样硬化之间具有相关性的假说。新近的研究证实，铁调素与代谢综合征具有相关性，认为在大约15％的代谢综合征患者中存在铁的超负荷，而这些患者中，大约50％的患者同时患有非酒精源性脂肪肝。近期，ValentiL等人的临床研究发现，在代谢综合征患者中，血清铁调素水平与血清MCP-1水平及血管损害程度相关，但对其发生机制未作进一步探讨。综上所述，尽管大量数据支持铁代谢与动脉粥样硬化的关系以及铁调素对体内铁代谢的调控作用，当尚未获得铁调素与动脉粥样硬化发生发展具有相关性的直接证据。本论文拟通过建立ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型，并分别在动物体内过表达和干扰铁调素基因，观察铁调素水平上调及干扰对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响并探讨其分子机制，从而明确铁调素在动脉粥样硬化发生发展及斑块不稳定中的作用。目的： 1.观察铁调素在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中的表达水平，明确斑块内铁调素表达的细胞类型; 2.在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型中，以基因干预的方法，明确铁调素对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响; 3.探讨铁调素导致斑块不稳定的可能机制。方法: 1、重组腺病毒干扰载体与表达载体的的构建及扩增扩增小鼠hepcidin基因，PCR产物与pMD18Tsimple载体连接，以EcoRI和BamHI为酶切位点，连接pMD18Tsimple-hamp和pIRES2-EGFP载体，保留测序验证正确的pIRES2-EGFP-Hamp;设计针对hepcidin的shRNA，插入到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中，保留测序验证正确的pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-hamp。将pIRES2-EGFP-Hamp和pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-hamp分别与腺病毒表达的目的载体pAD/CMV/V5-DEST进行LR重组反应，以获得含目的基因序列或目的基因干扰片段-GFP的腺病毒表达载体。将含目的基因序列的腺病毒表达载体转染293A细胞，包装并纯化病毒。通过超速离心及层析的方法浓缩及纯化病毒，获得病毒浓缩液。仅表达EGFP的腺病毒载体作为对照。 2、动物模型的建立及腺病毒转染动物实验分为两部分进行。在第1部分动物实验中，40只6周龄的雄性ApoE-/-小鼠随机分为对照组和模型组，对照组给予全程普通饮食，模型组全程高脂饮食喂养并在第2周末行左颈总动脉套管术。两组动物均于第13周末处死。在第2部分动物实验中，75只6周龄的雄性ApoE-/-小鼠全程给予高脂饮食喂养，第2周末行左颈总动脉套管术，术后8周随机分为3组并分别转染携带EGFP，EFP-hepcidin，和EGFP-hepcidinshRNA的重组腺病毒。3组动物继续高脂喂养3周后于第13周末处死。 3、血清指标检测第2部分动物处死前心脏采血，检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及血糖水平;同时检测3组动物血清中铁及铁调素的水平。 4、组织病理与免疫组化检测对左侧颈动脉斑块分别进行H&E染色、油红O染色、天狼猩红染色，并通过免疫组织化学方法检测斑块内胶原、脂质、巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌肌动蛋白(α-actin)含量。测量斑块面积，观察斑块的形态结构，计算易损指数。易损指数=（巨噬细胞+脂质）阳性面积百分比/（平滑肌细胞+胶原）阳性面积百分比。通过免疫组织化学方法检测斑块内炎性因子IL-6、MCP-1、TNFα、MMP-2以及铁相关蛋白hepcidin、H-Ferritin、L-Ferritin的表达水平。 5、免疫荧光化学检测以免疫双标的方法检测Hepcidin在斑块巨噬细胞及平滑肌细胞的表达;同样方法检测ox-LDL在3组斑块巨噬细胞内的表达。 6、non-Heme铁检测取新鲜颈动脉斑块组织，以原子吸收分光光度仪法检测3组斑块内non-heme铁含量。 7、实时定量RT-PCR检测取新鲜颈动脉斑块组织，提取RNA，实时荧光定量RT-PCR检测Hepcidin、H-Ferritin、L-Ferritin、IL-6、MCP-1、TNF-a、MMP-2等指标在mRNA水平的表达情况;取新鲜肝脏组织，提取RNA，实时荧光定量RT-PCR检测3组动物肝脏HepcidinmRNA水平的表达情况。 8、统计分析所有统计学数据均使用SPSS16.0软件分析。计量资料以均数±标准差表示，计数资料以数值和百分比表示。统计分析采用t检验、OnewayANOVA或LSDpost-hoc分析。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。结果： 1、成功构建重组腺病毒干扰载体与表达载体经重组腺病毒载体测序验证，Hep腺病毒表达载体及干扰载体构建正确，病毒包装成功，表达载体的病毒滴度为3.11×1012ifu/ml，干扰载体的病毒滴度为9.12×1012ifu/ml。 2、铁调素在ApopE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块中的表达情况及细胞定位动物实验的第1部分结果显示，Hepcidin在对照组颈动脉血管内几乎不表达，但在模型组颈动脉斑块内存在mRNA和蛋白水平的高表达。两组之间有显著统计学差异。铁调素主要在斑块内的巨噬细胞和平滑肌细胞表达，内皮细胞未见铁调素表达。 3、腺病毒体内转染效率腺病毒局部转染1周末GFP表达量明显增加，两周达到高峰，然后开始衰减，3周末实验结束时，斑块内仍可见GFP表达;转染两周后，GFP阳性面积与斑块面积的平均比值在EGFP组、EGFP-Hep组及EGFP-Hep-shRNA组间没有统计学差异。 4、腺病毒转染前后小鼠体重测量转染前后各组间小鼠体重无明显差异。 5、血液生化指标检测结果各组小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血糖未见统计学差异，铁调素基因干预对血脂、血糖水平无明显影响。 6、血清铁水平检测结果实验结束时，血清铁水平在三组间无显著统计学差异。 7、血清及肝脏Hepcidin水平检测结果实验结束时，ELISA检测血清hepcidin水平，三组间无显著统计学差异;各组小鼠肝脏Hepcidin在mRNA水平的表达无显著统计学差异。 8、斑块内Hepcidin表达检测结果 EGFP-Hep组与对照组相比，hepcidin的表达在蛋白和mRNA水平均升高，EGFP-Hep-shRNA组与对照组相比，hepcidin的表达在蛋白和mRNA水平均降低。 9、斑块面积检测结果三组小鼠颈动脉斑块面积平均值无显著差异。 10、斑块成分检测及易损指数测量结果油红O染色检测斑块内脂质成分，EGFP、EGFP-Hep和EGFP-Hep-shRNA三组脂质含量无显著差异;天狼猩红染色检测斑块内胶原成分，EGFP-Hep组较对照组胶原含量显著减少，EGFP-Hep-shRNA组较对照组胶原含量显著增加;MOMA-2免疫组化检测斑块内巨噬细胞，EGFP-Hep组较对照组巨噬细胞含量显著增加，EGFP-Hep-shRNA组较对照组巨噬细胞含量显著减少;α-SMactin免疫组化检测斑块内平滑肌细胞，EGFP-Hep组较对照组平滑肌细胞含量显著减少，EGFP-Hep-shRNA组较对照组平滑肌细胞含量显著增多;EGFP-Hep组易损指数较对照组显著增加，EGFP-Hep-shRNA组较对照组易损指数显著降低。 11、斑块内炎性因子检测结果 EGFP-Hep组IL-6、MCP-1、TNF-α和MMP-2的表达，无论在蛋白水平还是mRNA水平，较对照组均明显升高(P＜0.05);反之，EGFP-Hep-shRNA组IL-6、MCP-1、TNF-α和MMP-2的表达，无论在蛋白水平还是mRNA水平，较对照组均明显降低（P＜0.05）。 12、ox-LDL在巨噬细胞内表达水平检测结果免疫荧光双标及激光共聚焦显微镜观察ox-LDL在EGFP、EGFP-Hep和EGFP-Hep-shRNA三组巨噬细胞内的表达百分比，EGFP-Hep组较对照组显著升高，EGFP-Hep-shRNA组较对照组显著降低。 13、斑块内铁蛋白表达水平检测结果 EGFP-Hep组L-Ferritin和H-Ferritin的表达，无论在蛋白水平还是mRNA水平，较对照组均明显升高;EGFP-Hep-shRNA组L-Ferritin和H-Ferritin的表达，无论在蛋白水平还是mRNA水平，较对照组均明显降低。 14、斑块内non-heme铁检测结果原子吸收分光光度仪检测斑块内non-heme铁的水平。EGFP-Hep组较对照组明显升高;EGFP-Hep-shRNA组较对照组明显降低。结论： 1.铁调素在动脉粥样硬化斑块中高表达，巨噬细胞和平滑肌细胞是表达铁调素的主要细胞类型; 2.铁调素促进动脉粥样硬化斑块不稳定; 3.铁调素促进动脉粥样硬化斑块内铁沉积、炎症反应及巨噬细胞内脂质积聚，这可能是铁调素导致斑块不稳定的主要原因。收起

关键词 : 动脉粥样硬化斑块稳定性铁调素炎性因子铁沉积

5. 舒张性心力衰竭的基础和临床研究

[学位论文] 钟明山东大学 2000年博士导师: 张运共273页

关键词 : 舒张性心力衰竭冠脉循环 &beta 受体阻滞剂钙拮抗剂

6. ADAM17和ACE2基因干预对糖尿病心脏重构的影响及分子机制研究

[学位论文] 薛飞山东大学 2023年博士导师: 张运共261页

摘要 : 为了阐明重要的科学问题，我们在体内和体外实验中构建了ADAM17和ACE2基因双干扰的动物和细胞模型，进行了更加深入的探讨。论文ⅠADAM17基因干预对糖尿病心脏重构的影响及分子机制研究研究目的: 1.探讨心肌细胞特异性敲除ADAM17对糖... 展开为了阐明重要的科学问题，我们在体内和体外实验中构建了ADAM17和ACE2基因双干扰的动物和细胞模型，进行了更加深入的探讨。论文ⅠADAM17基因干预对糖尿病心脏重构的影响及分子机制研究研究目的: 1.探讨心肌细胞特异性敲除ADAM17对糖尿病小鼠左室重构和心功能的影响。 2.探讨糖尿病小鼠中ADAM17的表达和酶活性升高原因。 3.探讨心肌细胞特异性敲除ADAM17如何调控AMPK信号通路。 4.探讨心肌细胞特异性敲除ADAM17对自噬流的影响以及影响自噬流的具体环节。 5.探讨体外实验中ADAM17干扰在原代心肌细胞中的分子机制。研究方法: 1.敲基因小鼠的构建心肌细胞ADAM17基因特异性敲除小鼠采用CRISPR-Cas9技术构建，通过ADAM17flox/flox小鼠与α-MHC-Cre小鼠杂交后获得。将同窝出生的Cre阴性小鼠小鼠作为对照组小鼠。 2.动物实验的分组动物实验中共分为四个组:ADAM17fl/fl Control 组、ADAM17α-MHCKO Control组、ADAM17fl/fl DM 组、ADAM17α-MHCKO DM 组。 3.小动物超声检测小鼠心功能 Ⅱ型糖尿病小鼠造模成功后，进行小鼠超声测量评价小鼠的左心室收缩和舒张功能。 4.小鼠组织标本取材及病理检查 5.新生大鼠原代心肌细胞(NRCMs)的提取和H9c2细胞的分化 6.细胞实验的分组 7.RFP-GFP-LC3B自噬流检测 8.mRNA测序分析 9.Western Blot 实验 10.数据统计分析研究结果: 1.糖尿病小鼠的心脏中ADAM17表达显著增加与对照组相比，DCM组心脏中ADAM17mRNA水平和蛋白表达水平显著增高，ADAM17的酶活性显著增加。 2.ADAM17在心脏中的表达分布情况 ADAM17在心肌细胞中大量表达，在心肌成纤维细胞和内皮细胞中表达较少，此外与对照组小鼠相比,DCM组小鼠心脏心肌细胞中ADAM17的表达更多。 3.各组小鼠的体重、血糖和血脂情况心肌细胞特异性敲除ADAM17基因不影响小鼠的体重、血糖、血脂水平以及葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。 4.心肌细胞特异性敲除ADAM17显著改善糖尿病小鼠心室重构和功能心肌细胞特异性敲除ADAM17基因显著改善了糖尿病小鼠的左室重构以及收缩和舒张功能，单纯心肌细胞ADAM17基因敲除不影响生理状态下小鼠的左室重构和功能。 5.心肌细胞ADAM17缺乏显著改善心肌纤维化和心肌细胞凋亡 Masson结果显示，心肌细胞特异性敲除ADAM17可显著减轻糖尿病导致小鼠的心肌纤维化情况，而单纯心肌细胞ADAM17基因敲除不影响生理状态下小鼠的心肌纤维化。TUNEL染色与WB结果显示，心肌细胞特异性敲除ADAM17可显著减轻糖尿病小鼠心肌细胞凋亡情况，但不影响生理状态下小鼠心肌细胞的凋亡。在体外实验中得到了与体内实验一致的结果。 6.体内和体外实验中ADAM17的作用与其裂解ACE2密切相关 ACE2蛋白表达与mRNA表达的解偶联现象表明，在DCM的进程中ADAM17可能仅影响ACE2的转录后表达水平。小鼠血清中ACE2、Ang Ⅱ和Ang-(1-7)水平的检测结果显示，在生理和病理状态下ADAM17均在调节ACE2-AngⅡ/ Ang-(1-7)轴中发挥着关键作用。在体外实验中得到了与体内实验一致的结果。 7.ADAM17在调节心肌细胞中AMPK/mTOR信号通路和TFEB表达发挥着重要作用 WB结果显示，ADAM17基因敲除可逆转糖尿病所导致的AMPK通路失活和TFEB蛋白表达的抑制。体外实验得到了与体内实验一致的结论。此外，在心肌细胞中GP刺激抑制了 TFEB的核转位，而心肌细胞中抑制ADAM17基因能够显著增强TFEB的核转位。ADAM17通过调节4EBP1和p70S6K蛋白磷酸化影响了 AMPK/mTOR信号通路。 8.心肌细胞特异性敲除ADAM17显著改善心肌细胞的自噬流利用自噬抑制剂CQ和自噬双标腺病毒RFP-GFP-LC3B来测量自噬流，结果显示，GP刺激抑制了心肌细胞的自噬通量，心肌细胞中ADAM17的缺乏能够改善细胞的自噬通量。ADAM17可能是在自噬通量的早期通过减弱自噬小体的形成来抑制自噬通量，而心肌细胞中ADAM17缺乏可改善细胞的自噬通量。 9.ADAM17缺乏对自噬小体形成过程中相关蛋白表达的影响通过检测Atg3、Atg5、Atg7、Atg12和Beclin-1的蛋白表达水平，发现ADAM17在自噬小体的形成过程中发挥着重要作用，心肌细胞中ADAM17缺乏可促进自噬流中自噬小体的形成。 10.ADAM17缺乏通过改善心肌细胞的自噬流减少了凋亡反应在NRCMs细胞中，ADAM 17的缺乏通过改善心肌细胞的自噬流减少了凋亡反应。 11.ADAM17对ADRA1A/AMPK介导的心肌细胞自噬和凋亡的影响应用选择性AMPK抑制剂Dorsomorphin后检测细胞的自噬和凋亡水平。结果表明，心肌细胞中ADAM17的缺乏通过AMPK改善心肌细胞的自噬和凋亡，当AMPK被抑制时ADAM17的缺乏对细胞自噬和凋亡的改善作用也随之消失。 12.HIF-1α可能是糖尿病小鼠中ADAM17上调的上游介质 HIF-1α可能是介导糖尿病小鼠ADAM17上调的上游分子，这也解释了糖尿病小鼠心脏中ADAM17蛋白表达和活性升高的可能原因。实验结论: 1.心肌细胞特异性敲除ADAM17可显著减轻糖尿病小鼠的心肌细胞凋亡和心肌纤维化，并改善左室重构和功能障碍。 2.在Ⅱ型糖尿病小鼠心脏组织中，HIF-1α的激活上调了 ADAM17的蛋白表达和活性，进而导致心肌组织ACE2蛋白水平显著降低，血清中可溶性ACE2含量显著升高。 3.心肌细胞ADAM17敲除通过ADRA1A激活了 AMPK信号通路。 4.心肌细胞ADAM17敲除促进自噬流中自噬小体的形成，改善自噬流，进而减少心肌细胞的凋亡。论文Ⅱ ADAM17和ACE2基因单独和合并干预对糖尿病心脏重构的影响及分子机制研究研究目的: 1.探讨ADAM17缺乏是否通过ACE2发挥其改善糖尿病小鼠心室重构和心功能的作用。 2.探讨当心脏中ACE2被抑制时，ADAM17基因敲除是否能继续改善糖尿病小鼠心肌纤维化和心肌细胞凋亡。 3.探讨体外实验中当ADAM17和ACE2同时被抑制时心肌细胞自噬和凋亡的情况。研究方法: 1.动物实验的分组 2.小动物超声检测小鼠心功能 3.小鼠组织标本取材及病理检查 4.新生大鼠原代心肌细胞(NRCMs)的提取 5.细胞实验的分组 6.Western Blot 实验 7.数据统计分析研究结果: 1.各组小鼠的体重、血糖和血脂情况心肌细胞特异性敲除ADAM17基因以及心脏组织ACE2敲减并不影响糖尿病小鼠的BW、FBG、TG和TC水平。 2.ACE2在ADAM17敲除改善小鼠心室重构和心功能中发挥关键作用结果表明，当心脏中ACE2被抑制时，ADAM17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠左室重构以及左室收缩和舒张功能，说明ADAM17缺乏是通过ACE2发挥了改善糖尿病小鼠左室重构和功能的作用。 3.ACE2在ADAM17敲除改善糖尿病小鼠心肌纤维化中发挥关键作用 Masson结果显示，当心脏中ACE2被抑制时，ADAM17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠的心肌纤维化，说明ADAM17缺乏是通过ACE2发挥其抗糖尿病小鼠心肌纤维化的作用。 4.ACE2在ADAM17敲除改善糖尿病小鼠心肌细胞凋亡中发挥关键作用 TUNEL与WB实验结果显示，当心脏中ACE2被抑制时，ADAM 17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠的心肌细胞凋亡，说明ADAM17缺乏是通过ACE2发挥其改善糖尿病小鼠心肌细胞凋亡的作用。 5.ACE2在ADAM17敲除改善糖尿病小鼠心肌细胞自噬中的作用 ACE2在ADAM 17通过AMPK通路改善心肌细胞自噬的效应中发挥了关键作用，ADAM17缺乏是通过ACE2发挥了改善心肌细胞自噬的作用。实验结论: 1.ADAM17缺乏是通过ACE2发挥其改善左室重构和功能的作用，当心脏中ACE2被抑制时，ADAM17基因敲除无法继续改善糖尿病小鼠的左室重构和功能。 2.ADAM17缺乏是通过ACE2发挥改善糖尿病小鼠心肌纤维化和细胞凋亡的作用。 3.ADAM17缺乏是通过ACE2发挥改善糖尿病小鼠心肌细胞自噬的作用。收起

关键词 : 糖尿病性心肌病 ADAM17蛋白血管紧张素转换酶2 心脏重构心功能心肌纤维化细胞凋亡细胞自噬

7. 动脉粥样硬化大血管和微血管病变的干预靶点研究

[学位论文] 张凯山东大学 2014年博士导师: 张运共234页

摘要 : 论文Ⅰ氧化型低密度脂单白和他汀类药物对P4Hα1作用分子机制研究 1研究背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)不仅可以累及体循环的大中动脉也可累及前小动脉和小动脉导致微血管病变，这些血管病变可引起多个器官的形态和功能异常，其中... 展开论文Ⅰ氧化型低密度脂单白和他汀类药物对P4Hα1作用分子机制研究 1研究背景动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)不仅可以累及体循环的大中动脉也可累及前小动脉和小动脉导致微血管病变，这些血管病变可引起多个器官的形态和功能异常，其中，心、脑、肾是主要的AS靶器官，可导致心肌梗死、缺血性心肌病，脑卒中和慢性肾病，最终导致多器官功能衰竭和死亡。因此，深入研究AS大血管和微血管病变的发生机制和干预靶点，对于AS的防治具有重要的理论和实际意义。九十年代以来大量研究显示，AS易损斑块的形成是急性心脑血管事件的主要原因，因此，斑块易损性也成为国内外研究的热点，其主要的病理学特点包括较薄的纤维帽，较大的脂质核心和大量炎性细胞浸润。由于胶原是纤维帽的主要构成成分，因此斑块内胶原代谢紊乱是影响斑块易损性的重要因素。 4-羟基-脯氨酸羟化酶(P4H)是所有已知类型的胶原合成过程中的关键酶，能够催化位于X-脯氨酸-甘氨酸(X-Pro-Gly)重复序列中的脯氨酸变为羟脯氨酸，该反应在前胶原多肽链折叠成稳定的三螺旋结构的过程中发挥重要作用。P4H的同工酶P4Hα1在多种组织中均有表达，其表达减少可导致斑块内胶原含量减少，进而导致AS斑块不稳定，因而是决定斑块稳定性的重要因素。既往研究发现多种因素均能影响P4Hα1的表达，例如TGFβ1能够上调P4Hα1的表达而吸烟可抑制其表达;本实验室也曾发现炎症因子TNF-α和IL-6分别通过ASK1-JNK-NonO和ERK1/2-Sp1信号通路抑制P4Hα1的表达。氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，ox-LDL)是动脉粥样硬化形成和发展过程中的重要危险因素。研究发现ox-LDL能够激活基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)，增加胶原降解，进而诱导斑块不稳定。但是，ox-LDL能否通过调节P4Hα1的表达进而调节胶原合成目前尚未见报道。他汀类药物不仅具有降脂作用，还具有多种有益于心血管疾病的作用。大量研究证实他汀类药物能够增加斑块内胶原含量进而增加斑块稳定性，其机制为他汀类药物抑制MMPs的表达和活性以及增加了基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissueinhibitorsofmetalloproteinase-1，TIMP-1)的表达。然而，他汀类药物能否通过调节P4Hα1的表达进而调节胶原合成目前尚未见报道。 2研究目的 (1)探讨ox-LDL对P4Hα1的抑制作用及其机制并探讨辛伐他汀的干预作用; (2)观察辛伐他汀干预对斑块内P4Hα1表达的影响及并探讨其机制，揭示他汀类药物稳定动脉粥样硬化斑块的新靶点。 3实验方法 3.1细胞培养与处理 (1)在时间-效应实验中，我们用50ug/ml的ox-LDL刺激平滑肌细胞0、4、8、12和24小时，为保证ox-LDL不至于因为刺激时间过长而降解或者失活，每隔8小时更换含有50μg/ml的ox-LDL的新鲜培养基;在剂量-效应实验中，0、25、50ug/ml的ox-LDL分别刺激平滑肌细胞8小时，收集细胞。 (2)50ug/ml的ox-LDL或者50ug/ml的ox-LDL+辛伐他汀分别刺激细胞0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时，检测MAPK的激活。我们应用MAPK的抑制剂以及MAPK的小分子干扰RNA处理细胞，然后应用50ug/ml的ox-LDL刺激细胞8小时，收集细胞。 (3)在正常培养基或者ox-LDL刺激条件下，辛伐他汀干预细胞进行相关检测。 3.2动物模型的建立 120只8周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为两组—普通饮食组(n=40)和高脂饮食组(n=80)。2周后，所有小鼠均给予右侧颈总动脉套管以促进AS斑块形成。套管术后6周，普通饮食组随机分为两组(每组20只)—Mock1组(0.5％methylcellulose单独灌胃)和Sim1组（辛伐他汀溶于0.5％甲基纤维素，50mg/kg·d量灌胃）;高脂饮食组随机分为四组(每组20只)—Mock2组（0.5％甲基纤维素单独灌胃），SB组(p38MAPK抑制剂SB203580，2mg/kg·d腹腔注射)，PD组(ERK1/2抑制剂PD98059，2mg/kg·d腹腔注射)，Sim2组（辛伐他汀溶于0.5％甲基纤维素，50mg/kg·d量灌胃）。治疗6周后对小鼠称重行安乐死。 3.3RT-PCR 收集细胞，提取mRNA，检测P4Hα1mRNA水平。 3.4Westernblot 收集细胞和颈动脉斑块组织，提取蛋白，检测P4Hα1、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原、P-/T-p38MAPK、P-/T-JNK、P-/T-ERK1/2的表达。 3.5ELISA 收集细胞上清，ELISA试剂盒检测上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量。 3.6DiI-ox-LDL摄取实验 DiI-ox-LDL刺激细胞8小时，激光共聚焦照相观察细胞摄取情况。 3.7血脂检测动物试验结束前，收集小鼠空腹血清，检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。 3.8H&E、油红O、天狼猩红染色以及MOMA-2、α-SMactin和ox-LDL的免疫组化染色制备颈动脉斑块冰冻组织切片，行H&E染色观察大体形态，油红O染色检测脂质含量，天狼猩红染色检测胶原含量，MOMA-2和α-SMactin染色分别检测巨噬细胞和平滑肌细胞含量，计算易损指数。免疫组化染色检测斑块内ox-LDL的含量。 4结果 4.1细胞实验 4.1.1ox-LDL对P4Hα1的抑制作用在时间-效应实验中，50ug/ml的ox-LDL能够抑制P4Hα1的表达，在8小时时间点达到最大抑制效应;在剂量-效应实验中，随着ox-LDL浓度升高，P4Hα1的mRNA和蛋白水平呈递减趋势，在50ug/ml达到最大抑制效应。我们也应用Westernblot和ELISA检测了ox-LDL刺激细胞8小时后胶原的含量，结果显示ox-LDL显著抑制Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达和分泌。 4.1.2ox-LDL通过激活p38MAPK和ERK1/2信号通路发挥抑制作用 Ox-LDL刺激平滑肌细胞0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时，检测MAPK激活。结果发现p38MAPK和ERK1/2磷酸化水平在5分钟达高峰，之后虽然逐渐减弱，但在8小时仍显著高于0分钟时，说明ox-LDL对其激活可持续至8小时。但是，ox-LDL对JNK的磷酸化水平无明显影响。应用p38MAPK、JNK和ERK1/2的抑制剂或者siRNA处理细胞，然后应用ox-LDL刺激细胞检测P4Hα1的表达，发现抑制或基因沉默p38MAPK和ERK1/2后ox-LDL对P4Hα1的抑制作用明显减弱，而JNK的阻断或者基因沉默对P4Hα1的表达无显著影响。 4.1.3辛伐他汀逆转ox-LDL对P4Hα1的抑制作用辛伐他汀不能改变正常情况下平滑肌细胞P4Hα1的表达水平，但是可以显著逆转ox-LDL刺激细胞对P4Hα1的抑制效应，相应的增加了胶原的合成。探讨其机制发现辛伐他汀能够减少细胞对ox-LDL的摄取，抑制p38MAPK和ERK1/2的磷酸化。 4.2动物实验 4.2.1动物体重及血脂水平各组ApoE-/-小鼠的体重无显著差异。高脂饮食小鼠TC、TG、LDL-C较普通饮食小鼠显著升高而HDL-C显著降低;高脂饮食组内的四个亚组间各血脂指标无显著差异。 4.2.2辛伐他汀、SB203580和PD98059增加AS斑块稳定性普通饮食组内，辛伐他汀干预未显著改变斑块的易损指数。与Mock1组相比，Mock2组AS斑块的易损指数显著升高，提示动脉粥样硬化易损斑块造模成功。在高脂饮食组内，辛伐他汀、SB203580和PD98059干预能够显著降低斑块的易损指数。 4.2.3辛伐他汀上调不稳定斑块内P4Hα1 与Mock1相比，Mock2组P4Hα1的表达水平显著降低，提示不稳定斑块内P4Hα1生成减少。在普通饮食组内，辛伐他汀干预未明显改变P4Hα1的表达。但是，在高脂饮食组内，辛伐他汀、SB203580和PD98059干预显著增加斑块内P4Hα1的表达水平。与Mock2组相比，辛伐他汀治疗还能够降低斑块内ox-LDL的含量，抑制p38MAPK和ERK1/2的磷酸化。 5结论 (1)ox-LDL通过激活p38MAPK和ERK1/2信号通路抑制P4Hα1和胶原的合成。 (2)他汀类药物能够逆转ox-LDL对P4Hα1的抑制作用，其机制是他汀类药物减少了细胞对ox-LDL的摄取，抑制p38MAPK和ERK1/2的激活。 (3)在ApoE-/-小鼠模型中，他汀类药物可增加AS斑块内P4Hα1的表达和胶原合成，达到稳定斑块的作用。本研究揭示了他汀类药物稳定斑块的新的干预靶点，具有重要的学术意义。论文ⅡNonO在动脉粥样硬化斑块稳定性中的作用及机制研究 1研究背景急性冠脉综合征(acutecoronarysyndrome，ACS)是引起急性心脑血管事件的主要原因。目前已证实动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)易损斑块破裂是ACS发病的始动环节。研究发现易损斑块具有以下特点:较大的脂核、较薄的纤维帽、多种炎症细胞聚集以及斑块内胶原合成降解失衡。其中，胶原代谢是影响斑块稳定性的重要原因。 4羟基-脯氨酸羟化酶(P4H)是所有已知的21种胶原合成过程中的关键酶，能够催化X-脯氨酸-甘氨酸(X-Pro-Gly)重复序列中的脯氨酸变为羟基脯氨酸，从而促进前胶原多肽链折叠成稳定的三螺旋结构。作为P4H的同工酶，P4Hα1是胶原合成过程中的重要限速酶。抑制P4Hα1的表达可减少AS斑块内胶原合成，进而导致易损斑块形成;与之相反，过表达P4Hα1则会促进胶原的合成。既往研究发现TGFβ1能够促进P4Hα1的表达而吸烟可抑制其表达。近年来，本实验室张澄等研究发现在人类主动脉平滑肌细胞中，TNF-α具有抑制P4Hα1表达的作用，并提出了完整的信号转导通路即ASK1-MKK4-JNK1-NonO，首次提出NonO是P4Hα1合成的重要转录因子，在调节胶原合成过程中发挥重要作用，但是目前尚缺乏动物实验验证。 NonO（即人类的p54nrb蛋白）是一个大小为54KDa并在体内广泛表达的蛋白，是一个无POU结构域的八聚体结合蛋白，NonO含有两个核酸结合域，可直接与DNA结合参与转录调控;另外，NonO也可与其他转录蛋白相互作用调节基因表达。如前所述，本实验室研究发现NonO是P4Hα1合成的重要转录因子，在调节胶原合成过程中发挥重要作用。既往研究还发现NonO参与调节环磷酸腺苷(cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)信号通路，而该信号通路可参与炎症反应，促进TNF-α、IL-2、IL-6等炎症因子的表达;另外，NonO能够参与COX-23'-UTR的多聚腺苷酸化，影响其转录，而COX-2亦参与了炎症反应和AS的进展。上述研究提示NonO可能参与调节胶原代谢和炎症反应。综合国内外研究现状，NonO在AS中的作用研究尚未明确。对于大多数急性心血管事件来说，易损斑块的稳定性是影响事件的决定性因素，但目前，NonO是否影响易损斑块的稳定性尚无报道。 2研究目的 (1)体内实验中，通过过表达和基因沉默NonO观察NonO对易损斑块破裂率收起

关键词 : 动脉粥样硬化糖尿病肾病细胞外基质血管紧张素受体阻断剂微血管病变干预靶点

8. 调节性T细胞稳定动脉粥样硬化易损斑块的实验研究

[学位论文] 孟晓山东大学 2012年博士导师: 张运共225页

摘要 : 第一部分：调节性T细胞稳定动脉粥样硬化易损斑块的实验研究 1、背景：动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是多因素参与的复杂病理过程，近年来研究表明免疫反应，包括天然免疫和获得性的免疫机制在AS形成和发展过程发挥了重要作用。但是其... 展开第一部分：调节性T细胞稳定动脉粥样硬化易损斑块的实验研究 1、背景：动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是多因素参与的复杂病理过程，近年来研究表明免疫反应，包括天然免疫和获得性的免疫机制在AS形成和发展过程发挥了重要作用。但是其具体的作用机制并未得到完全的阐述。易损斑块是指易于形成血栓或可能迅速进展为罪犯病变的斑块，特点为具有较薄的纤维帽、较大的脂核（占斑块体积的40％以上）、平滑肌细胞密度低、胶原含量少、活化巨噬细胞和T淋巴细胞浸润增加，细胞因子合成和释放增加，部分斑块内部伴有明显的新生血管生成或斑块内出血的特点。调节性T细胞(CD4+CD25+regulatoryTcells，Tregs)作为特殊类型的CD4+T细胞亚群，是免疫系统的重要组成部分。Tregs参与机体自身的免疫耐受调节，终止活化的免疫反应，在调节免疫系统平衡、维持机体内环境的稳定以及控制自身免疫性疾病的进展中发挥了重要作用。Tregs数量的缺失或功能的失活将会破坏机体免疫内环境的稳定，导致自身免疫和炎症反应的无限放大。 Tregs在AS过程中的作用已经受到越来越多的关注。新的证据表明在ApoE-/-小鼠中给予Tregs治疗可阻止早期AS的形成，但其具体的机制尚未阐明。对于大多数急性心血管事件来说，易损斑块的稳定性是决定因素。到目前为止，Tregs是否影响易损斑块的稳定性尚未报道。 2、目的： (1)体内试验中，观察Tregs对易损斑块破裂率的影响和斑块内成分的改变。 (2)体外试验中，探讨Tregs稳定易损斑块的分子机制。 3、方法： 3.1、Tregs的分选分离8周龄雄性C57BL/6J小鼠脾细胞，利用磁珠分选技术获得纯化的Tregs。纯化的Tregs按要求分别溶于200μlPBS中，以备下一步操作。 3.2、动物模型的建立 8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂喂养2周后，右侧颈总动脉套管诱导AS斑块形成。颈动脉套管手术8周后，将ApoE-/-小鼠随机分为5组:A:Control组（无任何干预）;B:PBS组（尾静脉注射200μlPBS）;C:小剂量Tregs干预组（small-doseTregs组，SD组，尾静脉注射105Tregs）;D:中剂量Tregs干预组(moderate-doseTregs组，MD组，尾静脉注射3×105Tregs);E:大剂量Tregs干预组（large-doseTregs组，LD组，尾静脉注射106Tregs）。两周后重复上述操作一次。Tregs第一次注射第二天，将所有ApoE-/-实验小鼠置于容积为50ml大小、带通气孔的塑料管中（确保足够的通气和声音传播），同时进行噪音刺激。噪音刺激强度为110dB，噪音每次持续3秒，间隔为5分钟。每天持续6小时，总共四周时间。实验第14周末，ApoE-/-小鼠被处以安乐死。 3.3、体重、血脂和血压的测量实验的0周和14周末，分别测量每组ApoE-/-小鼠的体重。14周末，测量ApoE-/-小鼠的尾动脉血压，同时收集小鼠血清，检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。 3.4、组织病理学的检测制备右侧颈动脉切片，对颈动脉斑块进行H&E、天狼猩红和油红O染色，观察斑块的破裂率，并应用免疫组织化学的方法检测颈动脉斑块内MOMA-2、SMCs、MCP-1、TNF-α、IL-6、MMP-2、MMP-9和IL-17的表达，计算易损指数。 3.5、细胞共培养首先利用磁珠分选将Tregs和CD4+CD25-T细胞从健康人群外周血单核细胞中游离。人血管平滑肌细胞随机分为5组:Control组（未做任何处理）;CD25-组（细胞培养基中加入5×105CD4+CD25-T细胞）;Tregs组（细胞培养基中分别加入1.25×105，2.5×105和5×105Tregs）。在anti-CD3antibody（50ng/ml）存在的情况下培养40小时后，加入TNF-α（100ng/ml）继续刺激8小时。在另一组试验中，anti-TGF-β或anti-IL-10在Tregs和平滑肌细胞共培养前分别加入。 3.6、RT-PCR 收集右侧颈颈动脉组织或各组平滑肌细胞，提取RNA，检测颈动脉内Foxp3、TGF-β、IL-10、MMP-2、MMP-9以及平滑肌细胞内P4Hα1、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1、MMP-2、MMP-9mRNA的表达。 3.7、Westernblot 收集右侧颈颈动脉组织或各组平滑肌细胞，提取蛋白，检测颈动脉内Foxp3、TGF-β、IL-10、MMP-2、MMP-9、P4Hα1以及平滑肌细胞内P4Hα1、MMP-2、MMP-9、JNK、ASK1蛋白的表达。 3.8、ELISA检测收集各组细胞上清，检测细胞上清中Ⅰ、Ⅲ胶原、TGF-β和IL-10的水平浓度。 4、结果： 4.1、动物一般情况 5组ApoE-/-小鼠体重、血压以及血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平浓度无显著统计学差异。 4.2、Tregs阻止斑块的破裂对照组50％(8/16例)，PBS组50％(8/16例)，SD组43.8％(7/16例)，MD组12.5％(2/16例)和LD组12.5％(2/16例)的AS斑块发生了破裂。MD组和LD组斑块破裂率明显低于对照组、PBS组和SD组。 4.3、Tregs对斑块成分的影响 MD组和LD组颈动脉斑块内巨噬细胞含量、脂质含量和易损指数明显低于对照组、PBS组和SD组;而平滑肌细胞和胶原的含量则明显高于对照组、PBS组和SD组。 4.4、Tregs降低炎症因子的表达体内试验中，MD组和LD组颈动脉斑块内MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-17的表达明显低于对照组、PBS组和SD组。体外实验中，不同剂量的Tregs组MCP-1，VCAM-1和ICAM-1mRNA的表达均明显低于对照组和CD25-组。 4.5、Tregs降低MMP-2和MMP-9的表达体内试验中，MD组和LD组颈动脉斑块内MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平明显低于对照组、PBS组和SD组。免疫组化和westernblot的对MMP-2和MMP-9蛋白的检测也证明了相同的趋势。体外实验中，Tregs组MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白的表达均明显低于对照组和CD25-组。 4.6、Tregs对P4Hα1表达和ASK1-JNK通路的影响体内试验中，westernblot检测发现MD组和LD组颈动脉斑块内P4Hα1蛋白表达的水平明显高于对照组、PBS组和SD组。体外试验中，Tregs组P4Hα1mRNA和蛋白的水平明显高于对照组和CD25-组。ELISA证实Tregs组细胞上清中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的水平浓度较对照组和CD25-组明显升高。Tregs和平滑肌细胞共培养后，可部分的消除TNF-α对ASK1-JNK的激活作用。从而证实了Tregs通过抑制ASK1-JNK通路而促进P4Hα1的表达。 4.7、Tregs促进TGF-β和IL-10的表达体内试验中，MD组和LD组颈动脉斑块内TGF-β和IL-10的mRNA和蛋白的水平明显高于对照组、PBS组和SD组。体外试验中，收集各组细胞上清利用ELISA检测TGF-β和IL-10的水平，发现Tregs组TGF-β和IL-10的浓度明显高于对照组和CD25-组。 4.8、TGF-β或IL-10介导Tregs对P4Hα1和炎症因子的作用为进一步验证Tregs对炎症因子、MMP-2、MMP-9和P4Hα1的作用是否通过分泌TGF-β和IL-10而发挥的，我们预先将TGF-β或IL-10的中和抗体加入细胞培养基中。RT-PCR检测发现TGF-β和IL-10中和抗体部分抵消了Tregs对MCP-1、VCAM-1和ICAM-1mRNA的抑制作用。MMP-2和MMP-9mRNA和蛋白的表达在TGF-β和IL-10中和抗体加入后也明显升高。相反，加入中和抗体后，P4Hα1的mRNA和蛋白的表达则明显的降低。证明了Tregs部分是通过产生TGF-β和IL-10而介导对炎症因子、MMP-2、MMP-9和P4Hα1的作用。 5、结论： (1)在ApoE-/-小鼠易损斑块模型中，Tregs可剂量依赖性地稳定易损斑块，降低斑块的破裂率。 (2)Tregs稳定AS易损斑块的机制为抑制或减轻机体局部炎症反应，减少炎症因子和MMP-2、MMP-9的释放，促进抗炎因子分泌，提高P4Hα1的水平和抑制ASK1-JNK的信号通路。 (3)Tregs的作用部分依赖于本身分泌的TGF-β和IL-10。第二部分，他汀对易损斑块中调节性T细胞影响的研究 1、背景：动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)被认为是一种炎症性疾病，炎症在AS的发生和发展过程中发挥了关键作用。而炎症反应与免疫反应两者密切相关，许多重要的免疫因子可诱导和调控炎症反应，而包括单核巨噬细胞、T淋巴细胞和中性粒细胞在内的许多炎症细胞也具有重要的免疫功能。而在包括系统性红斑狼疮、全身性硬化症和类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病中均发现了AS加速的过程。他汀类药物除具有强有力降脂作用外，还包括改善内皮功能、抗炎、抗氧化等，可阻止AS的形成和促进AS易损斑块的稳定。此外，他汀类具有免疫调节的特性，抑制IFN-γ诱导的主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类抗原的表达和效应性T细胞的活化，而且研究认为他汀类药物稳定AS的作用部分的依赖于他们的免疫调节机制。调节性T细胞(CD4+CD25+regulatoryTcells，Tregs)是特殊的CD4+T细胞亚群，我们前文的研究发现Tregs具有抑制炎症细胞浸润和炎症因子释放，减轻炎症反应的特性。到目前为止，他汀类药物的治疗是否可以影响斑块内Tregs数量并未有相关报道。 2、目的： (1)观察他汀类药物治疗对AS斑块内的Tregs数量的影响。 (2)观察他汀类药物对ACS患者外周血中Tregs数量和功能的影响。 3、方法： 3.1、动物模型的建立 40只10周龄的雄性ApoE-/-小鼠给予高脂喂养2周后，予右侧颈总动脉套管以诱发AS斑块形成。套管术后继续高脂喂养，术后6周将ApoE-/-小鼠随机分为2组（每组20只）:A:辛伐他汀组（辛伐他汀溶于0.5％methylcellulose，按50mg/kg/d量灌胃）;B:Control组（同体积的0.5％methylcellulose单独灌胃）。治疗6周后处死动物。 3.2、血脂检测试验14周末，收集小鼠血清，检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平。 3.3、组织病理学的检测制备颈动脉切片，免疫组织化学的方法检测颈动脉斑块内Foxp3、IL-4、IL-1β、IFN-γ和IL-17的表达。 3.4、RT-PCR0收集右侧颈颈动脉组织，提取RNA，检测颈动脉内Foxp3、TGF-β、IL-10、IL-4、IL-1β、IFN-γ和IL-17mRNA的表达。 3.5、Westernblot 收集右侧颈动脉组织，提取蛋白，检测颈动脉内Foxp3、TGF-β和IL-I0蛋白的表达。 3.6、ELISA检测收集收起

关键词 : 主动脉瘤调节性T细胞动脉粥样硬化易损斑块他汀保护作用

9. 传统中药与介入治疗对动脉粥样硬化病变的作用及其机制研究

[学位论文] 马静山东大学 2020年博士导师: 张运共218页

摘要 : 论文Ⅰ应用基因芯片技术对中药通心络多靶点抗动脉粥样硬化作用的机制研究研究背景动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)是当今威胁人类健康的主要疾病，随着我国老龄化的加快，心血管疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。西医治疗是... 展开论文Ⅰ应用基因芯片技术对中药通心络多靶点抗动脉粥样硬化作用的机制研究研究背景动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)是当今威胁人类健康的主要疾病，随着我国老龄化的加快，心血管疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。西医治疗是目前ASCVD的主流疗法，然即便接受了优化药物治疗，ASCVD患者心血管事件的发生率仍较高。因此寻找新的抗ASCVD的药物势在必行。中医是中国传统文化的重要组成部分，是在古代哲学思想的指导下通过长期实践逐步形成和发展的独特医疗理论体系。近年来，中药防治心血管疾病取得了多方面进展。在基础研究领域，中医药运用活血、化痰、解毒、通络、益气等方法，在改善血管内皮功能、斑块稳定性、血小板活化、缺血再灌注、缺血预适应、左室重构、血管重构以及微循环功能等领域进行了广泛研究并取得了长足的进步。通心络是以中医络病学说为指导治疗ASCVD的经典中药复方制剂，广泛应用于慢性冠心病和脑卒中病的治疗。以往研究表明，通心络(TXL)可通过降脂、抗炎和抗氧化应激反应等多种机制发挥抗动脉粥样硬化(AS)的作用。TXL抗AS效果已被多项基础和临床研究所证实。由于TXL是由多种中草药成分组成的复方制剂，含有多种抗AS的活性成分，治疗机制仍未阐明，成为TXL研究中难以突破的关键科学问题。目前关于TXL作用机制的研究常针对西药抗AS治疗的已知靶点如降脂、抗炎和抗氧化应激，但这些机制无法完全解释TXL的抗AS作用。在本研究中，我们使用小鼠全基因组表达芯片检测了TXL对apoE-/-小鼠基因表达的影响，探讨TXL抗AS作用的可能机制。研究目的 1.明确TXL对apoE-/-小鼠AS斑块形成的影响。 2.探讨TXL发挥抗AS作用的可能机制。研究方法 1.TXL溶液制备体内实验，将TXL超微粉配制成不同浓度的生理盐水混悬液，小鼠每日0.1ml混悬液灌胃给药，单纯高脂喂养(HFD)组给予相同体积的生理盐水。体外实验，用细胞培养基溶解TXL后，制备TXL储存液。 2.实验分组 100只雄性apoE-/-小鼠(12周龄)，适应性普食喂养1周后，随机分为以下5组:对照(Control)组，单纯普食喂养16周;单纯高脂(HFD)组，单纯高脂喂养16周，小鼠每日0.1ml生理盐水灌胃;TXL低剂量(TXL-L)组，高脂喂养的基础上，给予小鼠TXL(0.38g/kg/d)0.1ml每日灌胃，喂养16周;TXL中剂量(TXL-M)组，高脂喂养的基础上，给予小鼠TXL(0.758g/kg/d)0.1ml每日灌胃，喂养16周;TXL高剂量(TXL-H)组，高脂喂养的基础上，给予小鼠TXL(1.5g/kg/d)0.1ml每日灌胃，喂养16周。 3.血液标本的留取及检测检测各组小鼠血脂和血糖水平。 4.组织病理学检测小鼠主动脉组织行大体油红O(Oil red O)染色，评价主动脉斑块负荷。主动脉根部连续切片后，油红O染色检测斑块内脂质含量，免疫组织化学染色检测斑块内巨噬细胞(MOMA-2)浸润和平滑肌(α-SMA)水平，天狼猩红(Sirus red)染色检测斑块内胶原含量，计算斑块易损指数。使用免疫组织化学染色的方法检测小鼠主动脉根部斑块内炎症因子TNF-α、IL-6、MMP-2的含量。 5.分子生物学检测: 对Control组、HFD组及TXL-H组小鼠主动脉组织行基因芯片检测，观察TXL对高脂饮食诱发AS而引起的基因表达的影响。 6.细胞培养体外培养小鼠原代巨噬细胞，给予不同处理后检测相应指标。培养基配制:高糖DMEM培养基450m1+FBS50ml。 7.体外实验分组及干预在原代巨噬细胞培养板中，加入不同浓度的TXL溶液预处理24小时，换液后加入氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)((40μg/ml)刺激4小时，4小时后吸弃细胞培养基，使用预冷的PBS溶液清洗3次，用于后续细胞RNA提取。 8.统计分析使用SPSS16.0(SPSS Inc，Chicago，USA)软件行统计分析。计量资料以均数±标准误表示，分类资料以百分比(％)表示。正态分布连续变量采用t检验或单因素ANOVA分析。当进行多重比较时，采用Bonferroni对p值进行校正。非正态分布连续变量采用非参数检验。p＜0.05为具有统计学意义。研究结果 1.TXL降低主动脉斑块负荷及主动脉根部斑块面积 HE染色结果显示，TXL可逆转高脂饮食引起的斑块面积增加(与HFD组相比，p＜0.05)，并呈现剂量依赖性，TXL-H组较TXL-L组斑块面积降低更为显著。大体油红O染色结果显示，与Control组相比，HFD组小鼠主动脉斑块负荷显著增加(p＜0.05)，TXL可降低高脂饮食引起的斑块负荷的增加(与HFD组相比，p＜0.05)，且TXL-H组降低斑块负荷的作用尤为明显，与TXL-L组相比，具有显著差异(p＜0.05)。 2.TXL增加斑块稳定性 TXL可显著减少高脂饮食引起的主动脉根部脂质沉积和巨噬细胞浸润，增加斑块内胶原及平滑肌细胞的含量(p＜0.05)，并呈剂量依赖性。TXL可显著降低斑块易损指数。 3.TXL减少斑块内炎症因子的表达 TXL能显著逆转高脂饮食引起的斑块内炎症因子表达的上调(p＜0.05)，而TXL不同剂量组之间，炎症因子的表达无显著差异。 4.TXL可逆转高脂饮食诱发AS而引起的基因表达的变化。在HFD组与Control组共筛选出3284个差异表达的基因，与Control组相比，2215个基因在HFD组表达上调，1069个基因在HFD组表达下调。即高脂饮食可引起小鼠主动脉组织3284个基因的差异表达。为了明确高脂饮食后在小鼠主动脉组织中差异表达的基因，有哪些可被通心络所调控，将高脂饮食后差异表达的3284个基因，与在HFD组和TXL-H组差异表达的632个基因进行匹配分析，筛选出TXL调控的AS相关基因。匹配分析结果显示，48个基因在HFD组被上调(与Control组相比)，而在TXL-H组表达水平降低(与HFD组相比);56个基因在HFD组被下调(与Control组相比)，而在TXL-H组表达水平升高(与HFD组相比)。将差异表达的基因进行生物信息学分析后发现，这些基因主要分布在细胞内;按照生物学过程进行分类，这些差异表达的基因主要影响了细胞的代谢过程;按照分子功能进行分类，差异表达的基因主要影响了细胞的结合功能。通过KEGG富集分析发现，差异表达的基因主要富集在炎症和代谢相关通路。研究结论 1.TXL可显著减缓小鼠主动脉斑块进展，抑制斑块内炎症因子的表达，增加斑块稳定性。 2.TXL可通过多靶点发挥抗AS作用，除已证实的降脂、抑制炎症和氧化应激反应等机制外，TXL通过调节神经内分泌、调节免疫反应以及调节机体代谢发挥心血管保护作用。论文Ⅱ支架植入对动脉粥样硬化非靶病变的作用及其机制研究研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)的发病率和死亡率在我国呈逐年增加的趋势，由于经皮冠状动脉介入治疗(PCI)创伤小，手术成功率高等优点，目前已成为冠心病的重要治疗方法。自1977年GruentzigA首次实施经皮冠状动脉成形术以来，PCI已迅速成为急性冠脉综合征(ACS)患者的一线治疗手段，极大地改善了冠心病患者的预后。 PCI治疗可使大多数缺血性心脏病患者获益，对于急性心肌梗死(AMI)患者，及早行PCI开通梗死相关血管，可以尽可能地挽救濒死心肌，降低患者急性期的死亡风险并改善长期预后。但对于稳定性缺血性心脏病(SIHD)患者，是否应行PCI治疗，目前仍存在争议。ISCHEMIA实验报道，对于中度或重度冠脉狭窄的SIHD患者，在优化药物治疗的基础上进行PCI术，与单纯接受优化药物治疗相比，长期随访过程中患者心血管事件的发生率及主要终点无显著差异。这一结果提示PCI未能改善SIHD患者的长期预后，即部分SIHD患者并未从PCI治疗中获益。在可能抵消SIHD患者PCI获益的因素中，PCI术后非靶病变(NTLs)的快速进展引起了更多的关注。 PCI术后NTLs快速进展的机制目前尚不明确。炎症反应可能在PCI术后NTLs快速进展的过程中起到重要作用。研究表明，对于稳定性冠心病患者，血清CRP水平在PCI术后显著升高，且术后72小时CRP的高表达与患者术后心血管事件的发生显著相关。PCI术后激活的炎症反应和氧化应激，是否在NTLs进展中发挥重要作用？明确这一问题，对于优化PCI治疗、减少急性心血管事件发生及改善患者预后，具有非常重要的临床意义。综上所述，我们提出以下假说:PCI术后炎症反应和氧化应激的激活是促进NTLs进展的重要因素。为验证假说并探讨PCI术后NTLs进展的可能机制，本研究拟采用新西兰大白兔腹主动脉动脉粥样硬化(AS)模型，分为支架植入组、假手术组和对照组，支架植入组于腹主动脉AS形成处植入支架，3个月后分别采用血管内超声和病理学方法评估支架植入术后NTLs进展情况，明确支架植入术与NTLs进展的关系。同时检测PCI或冠状动脉造影(CAG)后患者血清中炎症相关因子的动态变化，并在体外模拟PCI环境，进一步探讨支架植入引起NTLs进展的潜在机制。研究目的 1.观察支架植入术后NTLs的进展情况。 2.探讨炎症反应在支架植入术后NTLs进展中的作用及其机制。研究方法第一部分 1.动物AS模型构建采用成年雄性新西兰大白兔，通过球囊拉伤联合高脂饮食的方法构建兔腹主动脉AS模型:新西兰兔耳缘静脉麻醉后，行右侧髂动脉至腹主动脉球囊拉伤。2％利多卡因局部麻醉，分离皮下组织，暴露右侧股动脉并穿刺，沿导丝输送3.5mm×18mm预扩球囊至腹主动脉，以8-12atm压力充盈球囊，自腹主动脉至股动脉反复牵拉3次，以造成腹主动脉内皮损伤，撤出球囊及导丝，结扎右侧股动脉，缝合手术切口。给予40万单位青霉素肌注以预防感染。 2.实验分组 10周时，将实验动物随机分为以下3组: (1)支架组(n=10):行腹主动脉血管造影检查及支架植入术。分别在术中及术后三个月行腹主动脉血管内超声检查。 (2)假手术组(n=10):行腹主动脉血管造影检查，不植入支架。分别在术中及术后三个月行腹主动脉血管内超声检查。 (3)对照组(n=10):不进行有创操作。假手术组和支架组新西兰兔在10周时，分别进行腹主动脉造影和腹主动脉血管造影检查加支架植入术。支架组在支架植入术后给予拜阿司匹林40mg/天，直至实验结束。 3.血管内超声(IVUS)检查假手术组和支架组新西兰兔分别在介入术中及术后三个月行IVUS检查，使用BostonScientific公司的iLab血管内超声成像系统，获得并自动记录连续性血管内超声图像。IVUS图像数据由两名独立的观察者进行分析，取两次计算数据的平均值。 4.留取标本所有动物在22周时行安乐死，于左心室抽取枸橼酸钠抗凝血约15ml，置于黄色分离胶促凝管中，3000rpm室温离心10分钟，-80℃冰箱中保存备用。对于支架组和假手术组，将距离支架或血管最狭窄部位10mm以远的腹主动脉近心端，长度为50mm的血管段定义为NTLs，用于组织病理学分析，以评估斑块进展。对于对照组，我们将NTLs定义为距离髂总动脉分叉处20mm以远的腹主动脉近心端，长度为50mm的血管段，用于对照组的组织病理学研究。 5.NTLs斑块评价将处理后的血管组织块进行连收起

关键词 : 动脉粥样硬化通心络经皮冠脉介入治疗基因芯片技术

10. 高血压左室肥厚消退治疗的基础和临床研究

[学位论文] 徐瑞山东大学 2002年博士导师: 张运共219页

摘要 : 全文由两部分组成.一.高血压左室肥厚消退治疗的基础研究.目的：（1）在基因表达和调控水平阐明ACEI和AT<,1>RA消退高血压LVH的作用机制和相对疗效;（2）探讨LVH消退与左心舒张功能和冠脉血流储备的关系;（3）探讨LVH消退血流动力学改变与分子生物学改变之... 展开

关键词 : 左室肥厚血管紧张素转换酶抑制剂雷米普利氯沙坦肾素-血管紧张素系统