中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 赵家昌华中农业大学 2021年硕士导师: 周红波共100页

摘要 : 猪流感病毒（Swineinfluenzavirus,SIV）引发的猪流感是一种急性呼吸道传染病，猪感染该病后通常继发其他细菌及病毒性疾病，严重危害养猪业发展，造成巨大的经济损失。此外，由于猪在流感病毒传播过程中充当“混合器”的角色，同时给公共卫生造成巨大... 展开猪流感病毒（Swineinfluenzavirus,SIV）引发的猪流感是一种急性呼吸道传染病，猪感染该病后通常继发其他细菌及病毒性疾病，严重危害养猪业发展，造成巨大的经济损失。此外，由于猪在流感病毒传播过程中充当“混合器”的角色，同时给公共卫生造成巨大的挑战，严重威胁了人类生命健康安全。本研究是基于实验室前期利用CRISPR/Cas9技术进行全基因组敲除文库筛选猪流感病毒复制相关宿主基因的实验结果，通过单独探究部分候选基因，最终选择IGF2BP2和SLC12A6基因进行深入研究，探究其影响流感病毒复制的分子机制。 1.IGF2BP2对流感病毒复制的影响通过CRISPR/Cas9技术构建基因敲低多克隆细胞系并使用PCR在基因组水平、Westernblot在细胞蛋白水平进行验证，确认得到IGF2BP2敲低多克隆细胞系后，通过有限稀释的方法结合Westernblot对挑选的单克隆细胞株进行进一步验证，并检测敲除IGF2BP2基因后细胞活性的变化。最终筛选到完全敲除的NPTr-KOIGF2BP2单克隆细胞系，且NPTr-KOIGF2BP2细胞系和野生型NPTr细胞系的细胞活性差异不显著。与此同时，我们成功扩增并构建IGF2BP2表达质粒。通过Westernblot和测定病毒滴度的变化，证实了IGF2BP2能够影响流感病毒的复制，敲除IGF2BP2可以抑制流感病毒复制，过表达IGF2BP2可以促进流感病毒复制。接下来，我们进一步就IGF2BP2如何影响流感病毒复制的具体机制进行探索。通过对敲除IGF2BP2细胞系唾液酸受体的检测，发现敲除IGF2BP2并不影响α-2,3唾液酸受体和α-2,6唾液酸受体的合成与分布，并通过病毒吸附试验发现，敲除IGF2BP2不影响流感病毒吸附过程；通过Acidbypass试验，我们发现敲除IGF2BP2可以影响流感病毒的内吞过程；通过免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）试验在感染状态下，我们发现IGF2BP2能够和RNP复合物存在相互作用，且是不依赖RNA的相互作用；在共转染情况下，我们发现IGF2BP2能够和流感病毒NP、PB1存在相互作用，且分别在细胞核与细胞质中存在共定位现象；通过聚合酶活性试验我们发现，在过表达IGF2BP2的情况下，流感病毒聚合酶活性显著增加，但并不影响聚合酶亚基的表达量。SIV感染野生型NPTr细胞系后，内源性的IGF2BP2表达量随着病毒在细胞上的增殖呈现增加的趋势，且内源性IGF2BP2在细胞内的分布发生显著变化，由主要分布在细胞质中转变为整个细胞均质分布。最后，我们证实了敲除IGF2BP2能够广泛抑制不同种类流感病毒的增殖，对人流感PR8/H1N1、禽流感SH13/H9N2、猪流感F26/H1N1流感毒株的复制均有不同程度的抑制作用，无毒株特异性。 2.SLC12A6对流感病毒复制的影响我们利用CRISPR/Cas9技术运用同样的方法在NPTr-Cas9细胞上构建了SLC12A6敲除细胞系，并通过有限稀释的方法得到了基因敲除单克隆细胞系。同时，使用SIV感染NPTr野生型和NPTr-KOSLC12A6，通过Westernblot以及测定病毒滴度的变化，确定了敲除SLC12A6能够显著抑制流感病毒增殖，且在感染72小时后，敲除细胞系仍有较多存活。最后，我们证实了敲除SLC12A6能够广泛地抑制不同种类流感病毒的增殖，对人流感PR8/H1N1、禽流感SH13/H9N2、猪流感F26/H1N1流感毒株的复制具有不同程度的抑制作用。收起

关键词 : 猪流感宿主因子IGF2BP2 宿主因子SLC12A6 病毒复制

2. 大黄鱼（Larimichthys crocea）肠道菌群结构及其与宿主经济性状间的关系

[学位论文] 魏娜集美大学 2016年硕士导师: 马英共69页

摘要 : 大黄鱼主要分布在东亚沿海地区，是中国的一种重要的肉食性海水鱼类，拥有最大的海水网箱养殖量。近年来，随着大黄鱼海水养殖产业的迅速发展，产生了一系列的问题，这些问题与大黄鱼生物学性状相关，例如，生长速度放缓、性早熟、疾病爆发和肉质下降... 展开大黄鱼主要分布在东亚沿海地区，是中国的一种重要的肉食性海水鱼类，拥有最大的海水网箱养殖量。近年来，随着大黄鱼海水养殖产业的迅速发展，产生了一系列的问题，这些问题与大黄鱼生物学性状相关，例如，生长速度放缓、性早熟、疾病爆发和肉质下降等，这给养殖户造成了重大的经济损失。肠道微生物被认为是宿主“遗忘的器官”，这些微生物与宿主的生长、发育、生理和病理相关。许多研究报道了各种鱼类肠道微生物，但是，有关大黄鱼肠道微生物的报道很少，并且这些肠道微生物与大黄鱼经济性状间的关系也还不清楚，先前有的一些报道也只是利用了传统分离培养和基于16S rRNA基因的分子生物学研究。开展对形态、性别存在差异的宿主肠道菌群的研究，有助于了解这些差异跟肠道菌群之间的关系，在大黄鱼种质改良、开发益生微生态制剂及促进大黄鱼养殖产业健康发展方面具有重要意义。本研究利用PCR-DGGE和Illumina高通量测序技术研究大黄鱼肠道菌群结构及其与宿主经济性状间的关系，研究结果如下: 1.不同体重、不同性别的大黄鱼肠道菌群PCR-DGGE和Illumina测序分析 (1)在不同体重、性别的大黄鱼肠道中均检测到变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和软壁菌门。另外，利用Illumina方法还检测到放线菌门、浮霉菌门和硝化螺旋菌门。 (2)大黄鱼肠道菌群结构与宿主体重、性别相关。在门的水平上，变形菌门是大黄鱼肠道共生优势菌门，浮霉菌门和硝化螺旋菌门仅存在于大的雄鱼中。在属的水平上，大、中、小鱼肠道菌群在属的水平差异较大，同体重规格的雌、雄间肠道菌群也存在差异。大的雌性鱼肠道群落结构与其他组差异较大，中的雄性鱼肠道群落结构与其他组也表现了较大差异，小的雌雄间差异不大。DGGE的结果表明:水栖菌属和一些鞘脂单胞菌属和未培养的细菌克隆子是大鱼肠道的优势菌群，而小鱼的是一种未培养的细菌，中鱼优势菌属则包括支原体菌属、不动杆菌属和某些未培养的细菌等。不同性别鱼间也有差别，其中，铜绿假单胞菌和未培养的细菌是大的雌鱼的优势菌属，在小的雄鱼中也有检测到很多铜绿假单胞菌，短黄杆菌和香味菌属是小的雌鱼的优势菌属，在大的雄鱼中也有检测到很多。而用Illumina测序方法得到的结果有所不同:寡养单胞菌属和贪铜菌属是大的雌性鱼中的优势菌属，未分类的丛单胞菌科细菌细菌是大的雄鱼和小鱼共有的优势细菌属。 2.健康和患病的大黄鱼肠道菌群的PCR-DGGE和Illumina测序分析 (1)变形菌门、梭菌门和厚壁菌门是健康和患病大黄鱼肠道优势菌门，拟杆菌门在健康鱼组中明显减少，另外利用Illumina方法还检测到了浮霉菌门和软壁菌门。DGGE结果表明某些未知菌属的未培养细菌、鲸杆菌属、乳酸乳球菌属细菌是健康和患病大黄鱼肠道共有的优势菌群。 (2)DGGE和Illumina两种方法得到的健康大黄鱼肠道菌群多样性均大于患病鱼组，但差异均未达显著水平。DGGE结果表明:一些潜在益生菌，如乳酸乳球菌属和鲸杆菌属，在健康大黄鱼肠道中较丰富，而在患病鱼肠道中较少;相反，一些潜在致病菌，如木糖氧化无色杆菌和罗尔斯通菌等在发病鱼肠道中特异存在，在健康鱼中未检测到。另外，健康大黄鱼肠道中也检测到一些条件致病菌，如发光杆菌、弧菌等。Illumina结果中，弧菌属是健康鱼最优势菌属，而在患病鱼中则明显减少。Limnobacter（伯克氏菌科的一种属）是患病鱼的最优势菌属，而健康鱼中明显减少。乳酸菌科、弧菌属和莫拉克斯氏菌属是两组鱼肠道的差异显著的细菌类群。收起

关键词 : 大黄鱼肠道微生物菌群结构宿主体重宿主性别

3. eIF4A3对流感病毒复制的影响及其作用机制研究

[学位论文] 李国利华中农业大学 2016年硕士导师: 周红波共57页

摘要 : 流感病毒属于正粘病毒科的单股负链RNA病毒，基因组分为八个节段，其中编码PA、PB1、PB2和NP蛋白的基因高度保守，且它们与流感病毒vRNA结合以后形成vRNP，主要负责流感病毒的转录与复制。流感病毒与宿主细胞相互作用构成了病毒感染、复制、致病及免疫... 展开流感病毒属于正粘病毒科的单股负链RNA病毒，基因组分为八个节段，其中编码PA、PB1、PB2和NP蛋白的基因高度保守，且它们与流感病毒vRNA结合以后形成vRNP，主要负责流感病毒的转录与复制。流感病毒与宿主细胞相互作用构成了病毒感染、复制、致病及免疫的分子基础。因此，理解宿主因子与流感病毒的相互作用不仅有利于我们深入了解流感病毒生活周期，也有利于开发新的抗流感药物。本实验室在前期的研究中通过串联亲和纯化实验筛选到与聚合酶复合物互作的宿主蛋白eIF4A3(Eukaryotic translation initiation factor4A isoform3)。并且本研究证实该蛋白可以与流感病毒聚合酶亚基PB1相互作用，进一步发现该蛋白能够显著促进流感病毒的增殖，促进流感病毒的转录与复制。探究该蛋白促进流感病毒增殖的作用机制时我们发现eIF4A3过表达时可以促进流感病毒聚合酶活性，而且这种促进作用是通过提高聚合酶系统组装实现的。同时，eIF4A3干扰时可以显著抑制流感病毒vRNP核输出。这不仅拓展了现有的流感病毒与宿主因子相互作用网络，也为以后流感的防控提供了新的思路和方向。主要研究结果如下: 1 eIF4A3促进流感病毒增殖本实验室在前期的研究中通过串联亲和纯化实验筛选到与流感病毒聚合酶复合物互作的宿主蛋白eIF4A3，通过检测eIF4A3干扰之后对PR8及HM流感病毒mRNA水平的影响，初步确定了eIF4A3干扰之后可以显著抑制流感病毒复制。进一步通过TCID50实验验证eIF4A3对流感病毒增殖的影响，结果与上面一致，即eIF4A3干扰之后可以显著抑制流感病毒的增殖。 2流感病毒感染过程中，eIF4A3促进流感病毒转录，复制在A549细胞上将eIF4A3干扰和过表达之后感染HM，并于4h，6h，8h收样，通过荧光定量方法检测eIF4A3对流感病毒mRNA，cRNA和vRNA水平影响，同时通过Western检测该蛋白对流感病毒蛋白表达的影响。结果证实该蛋白在干扰之后可以显著抑制流感病毒复制，转录，过表达时能够显著促进流感病毒转录，复制。 3 eIF4A3可以和流感病毒聚合酶亚基PB1相互作用通过Co-IP实验我们发现eIF4A3能够与流感病毒聚合酶亚基PB1发生相互作用，而与其它亚基不存在相互作用，且在感染情况下eIF4A3与内源性PB1也存在相互作用;进一步通过激光共聚焦显微镜ZEISS检测PB1与eIF4A3的亚细胞定位情况，发现两个蛋白在空间上存在共定位，主要定位于胞核。 4 eIF4A3促进流感病毒聚合酶活性用293T细胞检测eIF4A3干扰与过表达时对流感病毒聚合酶活性的影响，发现该蛋白过表达可以显著促进流感病毒聚合酶活性，干扰之后可以显著抑制聚合酶活性。 5在聚合酶系统中，eIF4A3可以促进流感病毒聚合酶系统组装探究eIF4A3促进流感病毒聚合酶活性的原因，我们首先将eIF4A3过表达293T细胞，24小时后Western检测该蛋白对流感病毒聚合酶各个亚基及NP蛋白表达水平的影响，发现该蛋白对各个蛋白表达均没有影响，进一步通过Co-IP实验检测eIF4A3对该聚合酶系统组装的影响时发现，与对照相比，eIF4A3可以显著促进流感病毒聚合酶系统RNP组装。 6 eIF4A3干扰之后抑制流感病毒vRNP的核输出将eIF4A3干扰之后接毒HM，并于5h之后进行固定，透化，染色，利用激光共聚焦显微镜观察发现eIF4A3干扰之后可以显著抑制NP蛋白的核输出。 7 eIF4A3蛋白解旋酶功能在它对流感病毒影响中发挥重要作用为研究eIF4A3蛋白解旋酶功能在它对流感病毒影响中发挥的作用，我们将该蛋白DEAD区域进行突变，通过相对荧光定量方法检测该区域突变后对流感病毒复制的影响，结果发现eIF4A3突变之后，该蛋白对流感病毒促进作用消失，变为抑制。收起

关键词 : 流感病毒聚合酶活力宿主因子相互作用宿主蛋白

4. 信息检测与数字水印技术研究

[学位论文] 彭海龙北京邮电大学 2005年硕士导师: 胡正名共64页

摘要 : 本文在信息伪装相关技术中主要做了三方面工作，摘要如下：1)针对图像JPEG文件内容，根据预测滤波器对噪声具有整形的特点，提出一种新的水印方法，并且从理论上证明了这种水印信号和载体信号的关系，最后用假设检验理论分析了水印的检测过程，实验结... 展开

关键词 : 信息检测数字水印版权保护宿主图像宿主音频

5. 传输层协议SCTP拥塞控制优化策略研究

[学位论文] 黄灿灿华南理工大学 2006年硕士导师: 谢胜利共75页

摘要 : WCDMA R4的基于IP的软交换结构是核心网通向全IP网络的桥梁。为了能有力的克服由TCP/IP引起的诸多重大不利因素，IETF开发并于2000年提出了新的传输层协议——流控制传输协议(SCTP)。SCTP有很多强大的功能和特征，因此现在已经作为TCP的潜在替代协议而... 展开

关键词 : SCTP 多宿主多流 IPP FrSameRtoAlt

6. AsiaⅠ型FMDV灭活疫苗毒株不同宿主系传代中VP1基因的遗传变异研究

[学位论文] 朱晶晶新疆农业大学 2008年硕士导师: 符子华;冉多良共60页

摘要 : 口蹄疫是由口蹄疫病毒感染偶蹄动物所引发的高度接触性传染病。全世界范围内几乎每年都有口蹄疫暴发，所造成的直接经济损失巨大。口蹄疫病毒和其他RNA病毒一样具有极高的突变率，它在传代过程中的遗传变异分析，是口蹄疫疫苗研制中不可或缺的环节。... 展开

关键词 : Asia 活疫苗毒株宿主基因

7. 基于J2EE的网格宿主环境的设计与实现研究

[学位论文] 万军民上海交通大学 2005年硕士导师: 饶若楠共60页

摘要 : 网格是继Internet之后又一次重大的科技进步，它是集成和并行的计算与资源环境，其核心是在异构和分布式的网络环境中，实现资源共享(包括计算资源、存储资源、通信资源、软件资源、信息资源、知识资源等)，消除信息孤岛。目前，开放式网格服务架构（... 展开网格是继Internet之后又一次重大的科技进步，它是集成和并行的计算与资源环境，其核心是在异构和分布式的网络环境中，实现资源共享(包括计算资源、存储资源、通信资源、软件资源、信息资源、知识资源等)，消除信息孤岛。目前，开放式网格服务架构（OGSA）已经成为网格架构的标准。OGSA结合Web Service提出了网格服务的概念，用于解决服务的发现、动态服务的创建、服务生命周期的管理等与临时服务有关的问题。随着网格体系架构和Web服务架构的发展，业界开始认识到网格服务与Web服务的共通之处。于是，Globus提出了WSRF(Web Service Resource Framework)作为取代OGSI的新一代网格架构实现基础。把网格搭建在WSRF之上是一个具有重要意义的转变。著名的GlobusToolkit项目从3.9.x版本开始全面采用WSRF作为网格架构实现基础。网格宿主环境是承载网格应用的平台，是网格应用的运行环境。当WSRF成为网格的架构实现基础以后，网格宿主环境在理论上就是一个WSRF运行环境，即WSRF容器。本文基于GlobusToolkit WSRF框架，设计和实现了一个能无缝集成于Jboss环境的WSRF容器，所实现的WSRF容器符合J2EE规范，支持JNDI、热部署，支持EJB作为WS资源的实现，为用户提供一个开发、部署、监控和管理WSRF服务的集成环境。本文在分析WSRF规范及WSRF设计模型的基础上，提出了J2EE环境下的WSRF容器的概念模型和体系结构，并基于Globus Toolkit wsrf-core,在Jboss应用服务器环境中实现了一个WSRF容器，创建了一个开发、部署和管理WS资源的集成环境，使得J2EE应用与WSRF应用可以工作在同一个平台上。本文还在WSRF容器中实现了EJB资源的特性，即将EJB组件部署成为WS资源，提供了一个WSRF应用的组件式开发模式。同时，本文基于Jboss的部署器架构，实现了WSRF服务及EJB资源的热部署。基于所实现的WSRF容器，本文最后开发了一个运行于WSRF容器之上的网格应用系统：航空电子客票系统，通过这个应用实例，展示了基于WSRF容器的网格应用开发的方法和步骤。收起

关键词 : 网格 WSRF J2EE 宿主环境

8. 几类环境驱动的宿主间与宿主内（耦合）传染病动力学模型研究

[学位论文] 张育茹新疆大学 2023年硕士导师: 张龙共98页

摘要 : 从古到今，人类遭受了多种传染病的威胁,例如霍乱,艾滋,疟疾,流感,新冠等.因此构造数学模型来描述疾病传播机制具有重要的现实意义.病原体侵入人体到出现感染症状通常会经历一段时间,也就是疾病的潜伏期.此外,一些病原体不断发生变异,在宿主内与宿主间... 展开从古到今，人类遭受了多种传染病的威胁,例如霍乱,艾滋,疟疾,流感,新冠等.因此构造数学模型来描述疾病传播机制具有重要的现实意义.病原体侵入人体到出现感染症状通常会经历一段时间,也就是疾病的潜伏期.此外,一些病原体不断发生变异,在宿主内与宿主间两个层面上同时流行多种毒株.病原体在受感染的宿主中生长、传播或被消除，易感个体通过近距离接触感染者或环境中的病原体被感染,两个层面又相互影响.这些因素都给控制疾病造成了更大的挑战.基于此,本文分别建立并研究一类时滞霍乱模型，以及两类多毒株体内外耦合传播传染病模型. 第一部分（对应于第二章）,提出一类具有离散时滞与不同传染性的霍乱传染病模型.首先研究模型解的非负性和有界性,计算模型的平衡点和基本再生数,证明当R0＜1时,无病平衡点局部及全局渐近稳定,而当R0＞1时,地方病平衡点全局渐近稳定.我们发现时滞对于霍乱传播具有重要影响，忽略时滞会高估霍乱的传播，付出更多控制成本，造成医疗资源的浪费. 第二部分（对应于第三章）,建立一类具有双毒株合作感染及体液免疫的宿主内和宿主间耦合传播传染病模型,其中由于免疫逃避,抗体仅对毒株1有效.对于宿主内子系统,讨论所有可行平衡点的全局渐近稳定性.对于宿主间子系统,得到系统的基本再生数R0，当R0＜1时,无病平衡点是局部渐近稳定的，当R0＞1时,地方病平衡点是局部渐近稳定的,且疾病是一致持续的.通过计算,得到宿主间传播后向分支的存在性.我们发现当共同感染时,即使每个毒株的基本再生数都小于1,双毒株之间的相互合作会比单毒株更易导致疾病的发展. 第三部分（对应于第四章）,建立一类具有突变及免疫逃避的双毒株体内外耦合传播传染病模型,宿主间子系统包括直接传播与间接传播,此外还考虑了疫苗接种.对于宿主内子系统,推导基本再生数,得到平衡点的存在性和全局渐近稳定性.对于宿主间子系统,计算基本再生数R0=max{R01,R02}，分析平衡点的存在性和局部渐近稳定性,并讨论宿主间子系统在R02=1处的前向和后向分支情况.最后,通过数值模拟验证理论结果的有效性. 收起

关键词 : 环境驱动宿主间传染病宿主内传染病动力学模型

9. SARS相关冠状病毒跨宿主传播过程中S蛋白的受体适应性变异研究

[学位论文] 曲秀霞北京大学 2007年博士导师: 丁明孝;邓宏魁共94页

摘要 : 重症急性呼吸综合症(SARS)是由一种新的冠状病毒SARS-CoV引起的急性呼吸道传染病。研究人员从果子狸中分离到与人SARS-CoV同源性非常高的SARS样冠状病毒，并进一步证明了SARS-CoV是通过果子狸跨种传播到人类，为SARS-CoV的动物起源提供了证据。本文通... 展开重症急性呼吸综合症(SARS)是由一种新的冠状病毒SARS-CoV引起的急性呼吸道传染病。研究人员从果子狸中分离到与人SARS-CoV同源性非常高的SARS样冠状病毒，并进一步证明了SARS-CoV是通过果子狸跨种传播到人类，为SARS-CoV的动物起源提供了证据。本文通过比较人和果子狸SARS-CoVRBD区的基因序列信息，寻找和鉴定影响SARS-CoV感染不同宿主的关键氨基酸变异，从而在分子水平上阐释SARS-CoV的跨宿主传播中的适应性进化过程。对104株SARS-CoV的S蛋白RBD氨基酸序列变异进行分析发现，pcSARS-CoV和huSARS-CoV的S蛋白在从动物向人传播过程中承受了最大的位置选择压力，而S蛋白RBD区域发现存在6个氨基酸变异(344，360，472，479，480和487)。本课题以人SARS-CoV分离株BJ01为基础，将这六个氨基酸残基以不同组合分别替换为果子狸型SARS-CoV的相应氨基酸残基，结合SARS-CoV/HIV-Luc假病毒系统进行单轮感染分析。结果发现同时替换479/487两个氨基酸的S蛋白假病毒不能侵染表达hACE2细胞。进一步检测可溶性的BJ01S蛋白与ACE2的结合能力发现，含有N479K/T487S突变的S1蛋白几乎检测不到与ACE2的结合，而N479K或T487S突变也都在一定程度上降低了S1蛋白与hACE2的结合能力。这些结果说明N479K和T487R突变主要是通过改变S1蛋白与hACE2的结合能力使得相应S突变的假病毒不能利用hACE2侵染细胞。为了确定479位和487位氨基酸突变在SARS-CoV跨宿主传播过程中的作用，简单模拟跨宿主传播中可能的分子变异事件，本课题进一步以果子狸SARS-Cov分离株SZ3的S基因为基础构建了SZ3-N479，SZ3-T487，和SZ3-N479/T487的突变S基因，用这些S基因制备的假病毒感染HeLa-hACE2和HeLa-pcACE2细胞发现，将果子狸SZ3分离株的S蛋白479位和487位氨基酸残基替换为BJ01相应残基后，可以增加其侵染能力100倍。因此，479和487位的氨基酸残基的突变可能在SARS-CoV跨宿主传播过程中起关键作用。在蝙蝠体内发现SARS-CoV相似的病毒后，本课题组进一步利用HIV假病毒系统从分子水平上探讨了蝙蝠SL-CoV和人SARS-CoVS蛋白与不同ACE2的相互作用关系。假病毒感染实验表明，无论是蝙蝠SL-CoV的S蛋白还是人SARS-CoV的S蛋白均不能利用蝙蝠ACE2作为细胞受体。序列分析发现SL-CoV与SARS-CoVS蛋白在RBD区有很大差异，SL-CoV在S400-500之间的关键区域有两段缺失，这可能导致蝙蝠SL-CoV的细胞受体选择有很大不同。收起

关键词 : 冠状病毒蛋白受体受体适应性宿主传播重症急性呼吸综合症跨宿主传播

10. 东方巴贝斯虫入侵宿主红细胞受体的鉴定及虫体球状体蛋白的定位

[学位论文] 郭佳莹华中农业大学 2021年博士导师: 赵俊龙共184页

摘要 : 东方巴贝斯虫，寄生在水牛的红细胞内，会导致水牛出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，严重会造成水牛死亡，极大影响了水牛业的发展。自1997年本实验室报道并确立其为一种巴贝斯虫新种后，对其展开了一系列深入的研究。结果发现其只能对水牛致病，而不能感... 展开东方巴贝斯虫，寄生在水牛的红细胞内，会导致水牛出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，严重会造成水牛死亡，极大影响了水牛业的发展。自1997年本实验室报道并确立其为一种巴贝斯虫新种后，对其展开了一系列深入的研究。结果发现其只能对水牛致病，而不能感染黄牛，因此说明东方巴贝斯虫具有宿主特异性。围绕这一科学问题，本研究分别从宿主牛红细胞组分差异、东方巴贝斯虫入侵宿主水牛红细胞的受体以及虫体球状体蛋白三个方面进行了探讨，主要结果如下： 1.水牛、黄牛及奶牛的红细胞组分差异分析首先从1D、2D及shotgunLC-MS/MS（质谱）三个方面，分析水牛、黄牛及奶牛的红细胞组分差异。1D和2D的结果显示，水牛红细胞的蛋白数量明显少于黄牛及奶牛近一倍，尤其是分子量在15-25kDa之间的蛋白。ShotgunLC-MS/MS分别从水牛、黄牛及奶牛的红细胞中鉴定到491、1143以及1145个蛋白组分，分析发现水牛红细胞组分中有290个蛋白是其所特有的。随后进行GO分析，发现在分子功能方面，虽然归类到相同层级的蛋白数量黄牛及奶牛都明显高于水牛，但是归类到第三层级中的oxygenbinding（GO:0019825），水牛的蛋白数量却明显高于黄牛及奶牛，其中就包括只在水牛红细胞组分中鉴定到的gamma-globin和epsilon-globin。进而对这两种蛋白进行GO更深层级的分析发现，二者可能参与到了血红素结合以及铁离子结合等相关过程中，而这些过程均关联到红细胞代谢过程，说明水牛与黄牛及奶牛在红细胞代谢方面可能存在差异，值得进一步深入研究。 2.红细胞受体的鉴定本研究分别克隆表达了水牛红细胞的三个重要膜蛋白-血型糖蛋白A（GYPA）、血型糖蛋白C（GYPC）以及Duffy抗原/趋化因子受体（DARC），并分别进行了水牛、黄牛以及奶牛膜蛋白序列之间的比较分析。GYPA、GYPC以及DARC均是红细胞膜蛋白，且是血型糖蛋白，红细胞膜外侧均有唾液酸链连接。GYPA与GYPC属于单次跨膜蛋白，而DARC属于多次跨膜蛋白。比较水牛、黄牛及奶牛三者的GYPA、GYPC以及DARC基因发现，虽然有个别碱基的差异，但是总体的基因同源性较高。利用制备的水牛GYPC多克隆抗体同时孵育水牛、黄牛及奶牛的红细胞膜蛋白组分，发现其多抗也可以清晰识别奶牛及黄牛的GYPC蛋白，说明红细胞膜蛋白在不同种类牛中，保守性较高。同时也探索了GYPC与东方巴贝斯虫的互作蛋白，进行了初步筛选，发现GYPC可能与虫体的蛋白凝血酶敏感素相关无名蛋白1（TRAP1）存在互作关系，但还需进一步的实验验证。与此同时，比较了水牛、黄牛及奶牛红细胞表面唾液酸的含量，发现水牛红细胞唾液酸的含量略少于奶牛，而明显少于黄牛。 3.东方巴贝斯虫球状体蛋白4的克隆与定位在东方巴贝斯虫的基因组中鉴定到球状体蛋白4（SBP4），其ORF长度为945bp，无内含子，编码的蛋白分子量约为37kDa。利用感染东方巴贝斯虫的水牛阳性血清孵育SBP4重组蛋白，可以清晰的识别出相应大小的SBP4重组蛋白，说明东方巴贝斯虫的SBP4具有良好的免疫原性。同时，利用制备的多克隆抗体在东方巴贝斯虫的全虫抗原中识别其蛋白的天然形式，结果显示SBP4的天然大小约为37kDa左右，与预期大小相符。利用本实验室之前鉴定到的球状体蛋白3的多克隆抗体，通过间接免疫荧光实验，分别对SBP3以及SBP4的细胞定位进行探究发现，虫体未进入红细胞之前就已经表达相应的SBP3及SBP4蛋白，待虫体进入红细胞后，被虫体分泌到宿主红细胞中。二者先是呈小范围的点状被分泌到红细胞中，后在虫体增殖的阶段，会被虫体大量的分泌到整个红细胞胞质内，且SBP3的分泌量多于SBP4的分泌量。综合上述的结果，可以得出球状体家族的蛋白SBP3和SBP4会被虫体分泌到宿主红细胞内，可能参与到虫体与红细胞蛋白的互作中，其具体的功能需要进一步的探究。围绕东方巴贝斯虫只能够感染水牛而不能感染黄牛这一科学问题，本研究分别从不同种类牛红细胞组分的差异以及重要红细胞受体的差异进行比较分析。结果发现三个重要膜蛋白受体的序列同源性较高，而三种牛的红细胞代谢方面可能存在差异。由于宿主特异性的机制较复杂，需要大量的实验进行探索与验证，所以本研究为宿主特异性机制的解析提供了基础资料。收起

关键词 : 水牛东方巴贝斯虫宿主红细胞受体虫体球状体蛋白宿主特异性