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1. 中心体微管蛋白-α、γ及ki-67在宫颈上皮内瘤变及宫颈浸润癌中的表达及意义

[学位论文] 徐一鸣华中科技大学 2007年硕士导师: 濮德敏共39页

摘要 : 目的：检测中心体微管蛋白-α（tubulin-α）、中心体微管蛋白-γ、（tubulin-γ）、Ki-67在宫颈慢性炎症、宫颈上皮内瘤样病变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈浸润癌(invasivecervical carcinoma，ICC)中的表达，探讨tubulin-α、t... 展开目的：检测中心体微管蛋白-α（tubulin-α）、中心体微管蛋白-γ、（tubulin-γ）、Ki-67在宫颈慢性炎症、宫颈上皮内瘤样病变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宫颈浸润癌(invasivecervical carcinoma，ICC)中的表达，探讨tubulin-α、tubulin-γ、ki-67在从宫颈慢性炎症、CIN 到ICC发生发展过程中的作用。希望可以为进一步明确宫颈恶性病变起始阶段的发病机制提供帮助，以及为阻断宫颈恶变过程提供一种可能的思路。方法：选择2003年元月至2006年元月在我院住院，行Leep刀手术和全子宫切除术患者的标本，并经病理确诊的慢性宫颈炎23例、CINⅠ21例、CINⅡ20例、CINⅢ20例、ICC 21例，活检标本经甲醛固定，石蜡包埋，连续4μm切片。采用特异性鼠抗人tubulin-α单克隆抗体、鼠抗人tubulin-γ单克隆抗体、鼠抗人Ki-67单克隆抗体，用免疫组化SP技术，通过对比5组标本染色情况来研究tubulin-α、tubulin-γ，Ki-67在不同宫颈组织中的表达情况。结果： 1、tubulin-α与tubulin-γ的表达部位相似，在慢性宫颈炎、不同程度宫颈上皮内瘤变中主要表达于鳞状上皮和腺上皮组织细胞胞质内，染色呈黄色或淡黄色，间质纤维母细胞、淋巴细胞、单核吞噬细胞均不着色。在浸润癌组织中表达于整个上皮层和肿瘤细胞胞质内，间质偶见少量阳性细胞，染色呈棕黄色，且tubulin-α、tubulin-γ阳性率表达明显高于宫颈慢性炎症及宫颈上皮内瘤变各组（p<0.05）。以上各组阳性率依次升高，总体比较差异有显著性意义（p<0.01）：①tubulin-α在慢性宫颈炎组与CINⅠ组差异无显著性意义（p>0.05），CINⅡ、CINⅢ两组间差异无显著性意义（p>0.05），其余各组间相互比较差异均有显著性意义（p<0.05）。②tubulin-γ在慢性宫颈炎组与CINⅠ组，CINⅠ组与CINⅡ，CINⅡ与CINⅢ三对组间差异无显著性意义（p>0.05），其余各组间相互比较差异均有显著性意义（p<0.05）。 2、Ki-67主要表达在宫颈慢性炎症细胞、不典型增生细胞及浸润癌细胞胞核内，呈黄色或棕色染色。本实验中Ki-67的阳性率在慢性宫颈炎组、各组不典型增生及浸润癌组之间呈逐渐增高趋势，除慢性宫颈炎组与CINⅠ组，CINⅡ与CINⅢ,CINⅢ与ICC三对组间表达无显著性差异外（p>0.05），其余各组间表达均有显著性差异（p<0.05）。 3、tubulin-α、tubulin-γ和Ki-67在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变、宫颈浸润癌连续发展过程中的表达变化呈显著正相关。结论：tubulin-α、tubulin-γ和Ki-67的表达异常可能是宫颈癌发病的早期事件；tubulin-α、tubulin-γ的异常表达可能是宫颈恶性病变发生的机制；tubulin-α、tubulin-γ和Ki-67三者间可能存在相互影响和协同作用。收起

关键词 : 宫颈浸润癌宫颈上皮内瘤 Ki-67表达 tubulin-&gamma 表达 tubulin-&alpha 表达

2. 低温胁迫对甘蔗幼苗根系生长代谢的影响和相关基因α-tubulin的功能研究

[学位论文] 孙波广西大学 2016年博士导师: 杨丽涛共150页

摘要 : 甘蔗（Saccharum officenarum L.）是中国乃至世界第一大糖料作物，也是重要的能源作物。甘蔗是喜温作物，广泛种植于热带和亚热带地区，需要适宜的温度和湿度才能正常生长。近年来，世界气候变化异常，极端低温频发，寒害、冻害增多，给甘蔗生产造成... 展开甘蔗（Saccharum officenarum L.）是中国乃至世界第一大糖料作物，也是重要的能源作物。甘蔗是喜温作物，广泛种植于热带和亚热带地区，需要适宜的温度和湿度才能正常生长。近年来，世界气候变化异常，极端低温频发，寒害、冻害增多，给甘蔗生产造成巨大的损失。因此，开展甘蔗抗寒机制的研究具有重要的意义。目前，国内外对甘蔗低温胁迫下根系的形态、解剖、生理生化代谢和分子水平等方面研究的综合报道较少，本研究对甘蔗幼苗进行低温胁迫处理，从根系形态、细胞亚显微结构、生理生化代谢水平与常温下生长的甘蔗进行比较分析，以期探讨低温胁迫下甘蔗根系的生长、生理生化特性以及相关基因等指标与抗寒性的关系;并对甘蔗微管蛋白α-tubulin基因进行克隆和表达分析，同时对该蛋白进行原核表达、纯化并制备单克隆抗体;利用农杆菌介导法在烟草和甘蔗上进行遗传转化，初步验证α-tubulin基因在植物耐寒性等的功能。主要的研究内容与结果如下: 1.低温抑制了根系的生长。与正常条件生长的对照根系相比，低温胁迫下的根系表现根尖发黄，褐化，坏死;根长和根体积的增加量均显著低于对照;两个甘蔗品种（ROC22和GT28）的生物量均比对照明显降低，但根冠比差异不显著;两个品种相比较，发现ROC22地上部和地下部受低温影响显著高于GT28;超微结构观察结果显示:低温胁迫导致根尖细胞由方变圆，结构紊乱，细胞器减少，细胞膜破坏，细胞核解体，线粒体内嵴模糊，逐渐成为空泡状，部分溶解，ROC22细胞和细胞器受伤害程度大于GT28。 2.低温明显影响甘蔗根系蛋白质、糖含量以及蛋白酶活性。在低温胁迫下，ROC22可溶性蛋白质先略微上升后下降，GT28可溶性蛋白质先升高后下降再升高，且保持在较高水平;ROC22氨基酸含量表现为先升高后降低，在第5和9d显著低于对照，而GT28的氨基酸含量则始终高于对照。ROC22的可溶性糖和非可溶性糖含量逐渐下降，与对照差异显著，而GT28中可溶性糖逐渐上升，并高于对照组，但非可溶性糖含量则先上升后下降。根系中肽链内切酶活性先升高后下降，在弱酸性条件活性高于碱性条件下，并且GT28活性普遍高于ROC22;羧肽酶和氨肽酶在短时间低温下变化不显著，但在第9d时ROC22羧肽酶活性激增，氨肽酶活性速降，GT28中这两个酶活性变化不显著。 3.成功构建pET30a(+)-α-tubulin原核表达载体，利用IPTG诱导产生融合蛋白，原核表达结果显示重组的pET30a(+)-α-tubulin为49.6kDa。重组蛋白通过Ni2+-NTA柱亲和层析纯化和透析浓缩后制备单克隆抗体，用ELISA法检测α-tubulin单克隆的效价，结果表明本研究所制备的α-tubulin单克隆抗体的效价高于1∶512000。用WesternBlot检测甘蔗α-微管蛋白获得了特异性的条带，说明甘蔗α-微管蛋白单克隆抗体己被成功制备。 4.利用qRT-PCR技术分析了α-tubulin基因在甘蔗中转录水平的表达，结果表明α-tubulin基因在甘蔗茎中的表达量最高，根中次之，叶中最少。低温胁迫下，α-tubulin基因在根、茎和叶中的表达量是先升高后降低，最后差异逐渐减小。利用Western Blot方法检测α-tubulin基因在甘蔗中蛋白质水平的表达，发现ROC22根中α-微管蛋白表达逐渐下降，而GT28中α-微管蛋白先升高后下降，但都高于对照。 5.成功构建了烟草表达载体pBI121-α-tubulin和甘蔗表达载体pCAMBIA3300-α-tubulin。将分别受CaMV35S和Ubi启动子控制的pBI121-α-tubulin和pCAMBIA3300-α-tubulin通过运用农杆菌介导法转入野生型烟草植株K346和甘蔗品种ROC22，经PCR检测和GFP观察以及Bar基因检测确证获得转基因烟草和甘蔗。 6.对转α-tubulin基因烟草进行低温胁迫的功能验证。野生型和转基因烟草分别进行28℃（常温）和0-4℃（低温）处理，结果表明:低温胁迫对野生型和转基因型烟草叶绿素含量影响不显著。常温下，转基因烟草净光合作用显著高于野生型烟草，Pn、Gs、Tr显著高于野生型，而Ci显著低于野生型烟草。低温胁迫下，野生型和转基因烟草的光合作用受到抑制，并且都以呼吸作用为主，由强变弱后稳定。低温下，渗透物质可溶性蛋白质、可溶性糖和脯氨酸含量在转基因烟草中比野生型烟草中稳定。保护酶系统SOD和POD活性先升高后下降，但野生型烟草变化幅度显著高于转基因烟草;野生型烟草CAT活性逐渐下降，而转基因烟草CAT活性先下降后激增。说明α-tubulin的过量表达影响植物体内生理生化特性。 7.利用qRT-PCR技术对转甘蔗α-tubulin基因的烟草进行表达分析，发现α-tubulin基因在两种基因型烟草叶脉中表达最高，茎中次之，叶中最低;转基因烟草叶和茎中α-tubulin基因表达显著高于野生型烟草，而叶脉中α-tubulin基因表达低于野生型烟草。低温胁迫下，野生型烟草叶片中α-tubulin基因表达逐渐降低，而转基因烟草叶片中α-tubulin基因表达有升有降，但显著高于野生型烟草。WesternBlot检测α-tubulin蛋白质的表达，发现低温胁迫下，野生型烟草的α-tubulin蛋白质表达先升高后下降;而转基因型烟草中α-tubulin蛋白质表达先降低后升高然后降低再升高。以上结果表明，α-tubulin基因的过量表达提高了转基因烟草的耐低温性。收起

关键词 : 甘蔗幼苗根系生长代谢 &alpha -tubulin基因低温胁迫

3. α-tubulin和STK15基因在人脑胶质瘤中的表达及意义

[学位论文] 张少伟郑州大学 2013年硕士导师: 牛光明共56页

摘要 : 背景与目的：人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一，呈浸润性生长，与周围脑组织边界不清，不易彻底手术切除，且术后复发率高、致残率高、病死率高。目前胶质瘤采用手术切除为主及术后放、化疗等的综合治疗，但疗效欠佳。胶质瘤的治... 展开背景与目的：人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一，呈浸润性生长，与周围脑组织边界不清，不易彻底手术切除，且术后复发率高、致残率高、病死率高。目前胶质瘤采用手术切除为主及术后放、化疗等的综合治疗，但疗效欠佳。胶质瘤的治疗仍然是困扰神经外科医生的重要难题之一。近年来研究表明，胶质瘤的发生发展中存在原癌基因、抑癌基因及细胞周期调节相关基因等的突变及异常表达，因此研究上述基因在胶质瘤发生发展中的作用及寻找治疗的靶基因是当今神经外科的重要课题之一。微管具有广泛的生物学功能和独特的细胞动力学特性，在细胞染色体运动和有丝分裂过程中发挥着重要的作用。α-微管蛋白基因（α-tubulingene）编码α-tubulin参与组成微管和中心体等重要细胞组分。α-tubulin高水平表达出现在前列腺癌、乳腺癌及肺癌等癌变甚至癌前病变中。但关于α-tubulin的表达与人脑胶质瘤之间的关系报道较少。丝/苏氨酸激酶15基因(serine/threoninekinase15gene,STK15)是近年来发现的一种与中心体异常密切相关的癌基因，参与调节中心体的分离成熟、DNA合成后期/有丝分裂期转换(G2/Mtransition)、双极纺锤体的建立以及染色体的正确分离，在细胞内受到严格的时间和空间调控。研究表明，STK15多种肿瘤中存在基因扩增和蛋白高表达，与中心体的异常扩增及细胞恶性转化密切相关。α-tubulin和STK15的异常表达与多种肿瘤的发生及生物学行为密切相关。为此，我们采用RT-PCR技术检测α-tubulin、STK15mRNA在人脑胶质瘤标本中的表达情况，探讨两者在人脑胶质瘤中表达的生物学意义，为胶质瘤的靶向和个体化治疗提供依据。材料和方法：收集2011年7月至2012年6月郑州大学第二附属医院神经外科手术后经病理证实的人脑胶质瘤标本，共45例，其中男25例，女20例，年龄8～75岁，平均45.63±15.06岁。所有标本取自胶质瘤组织，无中心坏死区及肿瘤边界区组织。所有病例均为首次发病术前未经过放疗或化疗，按WHO神经胶质瘤病理分级方法（2007年）分为:Ⅰ级3例，Ⅱ级18例，Ⅲ级16例，Ⅳ级8例。21例Ⅰ～Ⅱ级为低度恶性组，24例Ⅲ～Ⅳ级为高度恶性组。另取12例非瘤脑组织作为对照。全部标本取出后-80℃深低温冰箱妥善保存。采用RT-PCR技术检测α-tubulin、STK15基因mRNA在胶质瘤组织和非瘤脑组织中的表达量，利用SPSS17.0软件进行统计学分析，取α=0.05为检验水准。结果： 1.α-tubulin基因mRNA的表达情况 α-tubulin基因的mRNA表达量在Ⅰ～Ⅱ级低度恶性胶质瘤组中为:0.905±0.047、Ⅲ～Ⅳ级高度恶性胶质瘤组中为:0.976±0.044、所有胶质瘤组织中为:0.943±0.058以及非瘤脑组织中为:0.367±0.028。经过统计分析显示，α-tubulin基因mRNA的表达在胶质瘤组织和非瘤脑组织之间、高度恶性胶质瘤组和非瘤脑组织之间、高度恶性胶质瘤组和低度恶性胶质瘤组之间以及低度恶性胶质瘤组和非瘤脑组织之间具有显著差异(P＜0.05)。 2.STK15基因mRNA的表达情况 STK15基因的mRNA表达量在Ⅰ～Ⅱ级低度恶性胶质瘤组中为:0.713±0.021、Ⅲ～Ⅳ级高度恶性胶质瘤组中为:0.779±0.018、所有胶质瘤组织中为0.748±0.038以及非瘤脑组织中为:0.455±0.020。经统计学分析显示，STK15基因mRNA的表达量在胶质瘤组织和非瘤脑组织之间、高度恶性胶质瘤组和非瘤脑组织之间、高度恶性胶质瘤组和低度恶性胶质瘤组之间以及低度恶性胶质瘤组和非瘤脑组织之间具有显著差异(P＜0.05)。 3.α-tubulin、STK15基因之间的相关性经统计学分析，α-tubulin和STK15两者基因mRNA在胶质瘤组织中的表达量呈正相关，Pearson相关系数r=0.754，P＜0.05，具有统计学的意义。结论： 1.人脑胶质瘤组织中α-tubulin及STK15基因的mRNA表达水平明显高于非瘤脑组织，且表达量随着胶质瘤病理级别的升高而升高。 2.α-tubulin和STK15mRNA在人脑胶质瘤中的表达呈正相关。收起

关键词 : 胶质瘤 &alpha -tubulin基因 STK15基因反转录RCR

4. 曲古抑菌素A联合多西他赛对肺腺癌A549凋亡和α-tubulin的影响

[学位论文] 张群成山东大学 2012年硕士导师: 姜淑娟共43页

摘要 : 目的:研究曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA)联合多西他赛(Docetaxel，Doc)对肺腺癌细胞株A549凋亡和α-tubulin的影响，以及caspase-3及survivin蛋白表达情况。方法:人肺腺癌A549细胞株培养于PRMI1640培养液中，按照分组:1、空白对照组2、TSA25... 展开目的:研究曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA)联合多西他赛(Docetaxel，Doc)对肺腺癌细胞株A549凋亡和α-tubulin的影响，以及caspase-3及survivin蛋白表达情况。方法:人肺腺癌A549细胞株培养于PRMI1640培养液中，按照分组:1、空白对照组2、TSA250nmol/L3、Docetaxel10ug/mL4、TSA250nmol/L+Docetaxel10μg/mL，药物处理24h后，光学显微镜观察不同处理组细胞形态学变化、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞抑制率、Hoechst33258染色法显示细胞凋亡、流式细胞术检测细胞凋亡及周期的变化;免疫细胞荧光化学检测Acetyl-α-tubulin蛋白的表达变化;Westernblot检测Acetyl-α-tubulin、survivin蛋白及caspase-3的变化。实验数据以x±s表示，SPSS15软件进行x2检验、t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。结果:1、光学显微镜下观察细胞形态学变化 ①Control:细胞贴壁紧密，细胞与细胞之间边界清晰，无悬浮死细胞。 ②TSA250nmol/L:细胞变大或有星状细胞出现，细胞间隙增宽，偶可见悬浮死细胞。 ③Docetaxel10μg/mL:细胞变小变圆，可见悬浮死细胞。 ④TSA250nmol/L+Docetaxel10μg/mL:与对照组及单独用药组相比，细胞明显皱缩变圆，同时可见大量悬浮死细胞。 2、四甲基偶氮唑盐（MTT法）检测不同分组对细胞生长的抑制作用药物处理24h，Docetaxel对A549细胞的抑制作用具有浓度依赖性，联合TSA250nmol/L与单一用药相比抑制率明显增加;Docetaxel10μg/mL、TSA250nmol/L细胞抑制率分别为(30.6±2.5)％、(10.5±1.2)％，Docetaxel10μg/mL+TSA250nmol/L组抑制率(65.6±3.5)％，明显高于单药组(p＜0.05)。 3、Hoechst33258染色法观察药物处理后细胞核的变化按照不同分组药物处理细胞24h，荧光显微镜下观察细胞核变化，凋亡细胞核出现染色质凝聚，染色强度增强，呈致密浓染的块状或颗粒状荧光以及凋亡小体形成，与单一用药及对照组相比，联合用药组细胞凋亡明显增加。 4、流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期 AnnexinV/PI结果显示: ①Control:(1.2±0.5)％ ②TSA250nmol/L:(17.6±1.8)％ ③Docetaxel10μg/mL:(39.2±3.7)％ ④TSA250nmol/L+Docetaxel10μg/mL:(64.2±4.2)％联合用药后细胞凋亡率明显增加，G2/M期阻滞更加明显，差异具有统计学意义。 5、免疫荧光细胞化学检测Acetyl-α-tubulin蛋白的表达的变化 TSA(250nmol/L)、Docetaxel(10μg/mL)单独或联合处理细胞24h后，显微镜下观察Acetyl-α-tubulin蛋白的变化，同一曝光度下，可以看出TSA与Docetaxel联合处理组胞浆Acetyl-α-tubulin蛋白表达与对照组及单独药物处理组相比，荧光强度明显增加。 6、TSA与Docetaxel联合对Acetyl-α-tubulin、caspase-3和survivin表达的影响 TSA(250nmol/L)与Docetaxel(10μg/mL)单独或联合处理细胞24h后，与单独药物处理组及对照组相比，TSA联合Docetaxel可促使α-tubulin乙酰化、减少survivin蛋白的表达以及使活化casapase-3增加。结论:曲古抑菌素A联合多西他赛具有协同作用，可能机制是促进细胞凋亡、增强G2/M期阻滞，促使α-tubulin乙酰化、减少survivin蛋白的表达以及使活化casapase-3增加。收起

关键词 : 曲古抑素A 多西他赛肺腺癌 A549细胞株 &alpha -tubulin蛋白抑制作用

5. SHH的激活对永久性脑缺血大鼠细胞骨架蛋白α-tubulin、MAP-2表达的影响

[学位论文] 陈苗苗郑州大学 2014年硕士导师: 白宏英共61页

摘要 : 背景和目的：目前，人类预期寿命延长，老龄化进展提速，再加上人们生活水平提高后膳食组成结构的改变和体育锻炼的缺乏，使得缺血性脑血管病的发病率和患病率逐年增高，严重危害人们身心健康，因此研究和防治脑缺血已成为目前紧要任务。脑缺血... 展开背景和目的：目前，人类预期寿命延长，老龄化进展提速，再加上人们生活水平提高后膳食组成结构的改变和体育锻炼的缺乏，使得缺血性脑血管病的发病率和患病率逐年增高，严重危害人们身心健康，因此研究和防治脑缺血已成为目前紧要任务。脑缺血区分缺血中心区及其周围的缺血半暗带区域，而缺血半暗带区内神经元的损伤具有可逆性，因此促进该区神经元的可塑性有利于损伤后神经元的修复，由于脑内神经细胞的存活及功能状态与细胞骨架蛋白的动态变化有着密切关系，且细胞骨架蛋白可促进神经元的生长发育及其可塑性，因此研究如何增加细胞骨架蛋白在神经修复中的作用，改善患者预后，具有重要的意义。 Sonic Hedgehog(Shh)信号转导通路是hedgehog信号转导途径的主要的信号通路之一，近年研究发现Shh信号通路与细胞骨架蛋白重塑有密切关系。Shh信号通路的激活可促进细胞骨架蛋白表达含量的增加，并增加其稳定性。微管是细胞骨架体系中主要成分之一，α-tubulin是组成微管的重要组成成分。神经系统中，微管蛋白不光是神经细胞发生的标志蛋白，亦是受损神经元结构和功能恢复的关键蛋白。微管结合蛋白-2(MAP-2)也是构成细胞骨架系统的主要成分之一，是神经元中的标志性微管相关蛋白，与神经元的再生、凋亡及可塑性有关。然而目前有关Sonic Hedgehog信号通路对脑卒中的研究在血管再生、氧化应激方面有所涉及，而对细胞骨架蛋白的研究鲜见。 Shh信号通路主要由Shh、Ptch、Smo和Gli蛋白组成，其中Gli-1蛋白是Shh信号通路主要的下游靶基因，Shh不足时，Gli-1表达降低，Shh激活时，Gli-1表达增加，因此Gli-1常常作为检测Shh信号通路激活的标志性分子。Purmorphamine可与Shh信号通路中的Smo蛋白结合，并使Smo蛋白空间构象发生相应改变继而激活Shh信号通路的下游分子，是Shh信号通路的特异性激动剂。本实验采用大鼠急性大脑中动脑脉缺血模型，观察应用purmorphamine激活Shh信号通路后缺血大鼠脑组织神经元内α-tubulin、MAP-2的表达水平变化，以探讨Shh信号通路的激活对永久性脑缺血大鼠细胞骨架蛋白的影响，为缺血性脑血管病的治疗提供新的线索。材料与方法：选取健康成年雄性清洁级SD大鼠96只，体重220±30g，采用线栓法制作SD大鼠急性大脑中动脉脑缺血(MCAO)模型。将96只SD大鼠随机分为三组:即假手术组、缺血组、药物干预组，各组再分为1d、3d、7d、14d四个亚组，每个亚组8只大鼠。Purmorphamine在使用之前用二甲基甲酰胺(DMF)溶液使之完全溶解。药物干预组大鼠在模型制作完毕后按0.69mg/Kg的剂量给予purmorphamine溶液腹腔注射，假手术组及缺血组大鼠则在术后给予相应剂量的单纯DMF溶液(0.69mg/Kg)应用相同的方式注射。行使手术后的大鼠清醒后，对其认真观察神经功能缺损状况并进行神经行为学评分，模型成功者于既定时间点将其处死，根据实验要求用相应方法取出脑组织。本实验用免疫组织化学方法测定脑缺血后不同时间点各组大鼠脑组织α-tubulin的表达，用RT-PCR法测定不同时间点各组大鼠MAP-2、Gli-1的表达。数据分析：采用SPSS21.0对数据进行统计学处理，实验结果用均数±标准差((x)±s)表示。组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，检验水准取α=0.05。结果： 1.免疫组化法测定α-tubulin表达情况α-tubulin阳性表达反应主要位于神经元的胞质及胞核中，也可表达于胶质细胞及轴突。假手术组各时间点α-tubulin阳性反应较强，缺血组第1d、3d下降较为明显，随着时间延长，阳性表达逐渐增加，7d、14d表达趋于稳定。药物干预组与缺血组相比，各时间点α-tubulin的表达均明显增多，差异具有统计学意义。 2.用RT-PCR法测定MAP-2表达情况MAP-2的表达主要位于神经元胞体和树突。与假手术组相比，缺血组与药物干预组MAP-2的表达都较低(p＜0.05)。缺血组MAP-2在缺血后表达降低，第1d、3d表达较低，随缺血时间的延长，表达量增加，7d、14d表达增加趋于稳定。给药后，在缺血各时间点的表达与缺血组相比有明显差异(p＜0.05))。 3.用RT-PCR法测定Gli-1表达情况假手术组脑组织内因Shh信号通路未激活，Gli-1的表达水平很低，与假手术组比较，缺血组和药物干预组Gli-1的表达增高，差异具有统计学意义(p＜0.05)。缺血组和药物干预组Gli-1的表达在1d最高，之后有所下降，但表达量仍然较高。药物干预组与缺血组各时间点相比，药物干预组Gli-1的表达明显增高，差异有统计学意义(p＜0.05)。结论： 1.应用purmorphamine可有效促进Shh信号通路中下游分子Gli-1的表达; 2.激活Shh信号通路可促进缺血后脑组织内α-tubulin、MAP-2表达增加，这可能是其减轻脑缺血后神经损伤的机制之一。收起

关键词 : Shh信号通路永久性脑缺血微管结合蛋白-2 &alpha -tubulin蛋白细胞骨架蛋白神经损伤

6. ERCC1和β-tubulinⅢ在胃癌组织中的表达及其临床意义

[学位论文] 刘庆云大连医科大学 2012年硕士导师: 孙秀华共43页

摘要 : 背景:胃癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，在许多国家发病率都很高。据估计，世界范围内最常见的恶性肿瘤中胃癌占第四位。在日本，胃癌是男性最常见的恶性肿瘤，而在北美，胃癌是少见的肿瘤之一。在发病部位上非贲门部的胃癌有明显的地区差异。日... 展开背景:胃癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，在许多国家发病率都很高。据估计，世界范围内最常见的恶性肿瘤中胃癌占第四位。在日本，胃癌是男性最常见的恶性肿瘤，而在北美，胃癌是少见的肿瘤之一。在发病部位上非贲门部的胃癌有明显的地区差异。日本、韩国、中国、中国台湾、秘鲁、哥斯达黎加等国家和地区此类癌发病率较高。据统计，胃癌在我国男性的恶性肿瘤发病占第二位，仅次于肺癌。胃癌治疗以手术为主，但5年生存率未超过50％，总的来说胃癌患者术后5年生存率为20％-30％，因此术后辅助化疗在术后治疗中占有重要地位。以铂类和紫杉类药物为主导的化疗在胃癌的术后辅助化疗中越来越受到关注。但肿瘤对化疗药物的耐药性降低了化疗疗效。对药物耐药机制的研究有利于临床上选择合适的化疗药物。ERCC1是核苷酸切除修复途径的重要因素，是顺铂耐药的重要机制之一，在顺铂耐药中起着重要作用，成为近年研究的一个热点，且已取得了较大进展。β-tubulinⅢ是微管结构的主要组成，而微管是细胞骨架的重要组成部分，在有丝分裂中起重要作用，与紫杉类药物耐药有关，是紫杉类药物作用的靶点，近年来得到了更多的关注。本研究旨在探讨ERCC1和β-tubulinⅢ在胃癌组织中的表达情况，同时研究二者在行含铂类和紫杉类辅助化疗的胃癌患者肿瘤组织中的表达情况、与临床病理特征的关系及分别对含铂类和紫杉类辅助化疗患者生存期的影响，为胃癌个体化治疗提供参考。目的:应用免疫组织化学方法检测ERCC1和β-tubulinⅢ蛋白在胃癌不同组织类型中表达是否有差异，分析ERCC1和β-tubulinⅢ蛋白表达与胃癌临床特征及生存的相关性，探讨ERCC1和β-tubulinⅢ蛋白表达对含铂类药物和含紫杉类药物辅助化疗患者生存期的影响，为胃癌个体化治疗提供参考。方法:采用回顾性研究方法，收集2006年1月1日至2011年10月1日大连医科大学附属第二医院34例胃癌根治性手术患者临床资料及病理蜡块，其中22例胃癌根治性手术术后行含铂类辅助化疗，23例术后行含紫杉类辅助化疗。应用免疫组织化学方法检测ERCC1和β-tubulinⅢ在胃癌病理组织中的表达，采用x2检验分析ERCC1和β-tubulinⅢ蛋白表达与胃癌临床特征的相关性。采用Kaplan-Meier方法分析ERCC1和β-tubulinⅢ蛋白表达对含铂类和紫杉类药物辅助化疗胃癌患者生存期的影响。采用SPSS18.0软件进行统计学分析。结果: 1.34例胃癌患者中，ERCC1阳性表达者16例，阳性表达率47.0％，β-tubulinⅢ阳性表达者15例，阳性表达率44.1％。ERCC1和β-tubulinⅢ在胃中分化腺癌、低分化腺癌及印戒细胞癌三种组织学类型中的表达无统计学差异(P=0.923)、(P=0.972)。 2.ERCC1和β-tubulinⅢ的表达与性别、年龄、发病部位、肿瘤大小、浸润深度、组织学分型、淋巴结转移、远处转移、TNM分期无关。 3.ERCC1阳性表达与阴性表达患者无病生存期(DFS)分别是11个月和14.5个月，P=0.074，差异无统计学意义。ERCC1表达阳性患者中位生存期(OS)20月，阴性表达患者中位生存期(OS)23.5月，P=0.012，有统计学意义。 4.β-tubulinⅢ阳性表达与阴性表达患者无病生存期(DFS)分别是10个月和15个月，P=0.004，有统计学意义。β-tubulinⅢ表达阳性患者中位生存期(OS)18个月，阴性表达患者21月，P=0.03，有统计学意义。 5.ERCC1阳性与阴性表达患者，接受含铂类辅助化疗总生存期分别是20个月和25个月，P=0.012，有统计学差异。 6.β-tubulinⅢ阳性与阴性表达患者，接受含紫杉类辅助化疗总生存期分别是17个月和23个月，P=0.042，有统计学差异。 7.ERCC1和β-tubulinⅢ在生存时间上共表达阳性低于共表达阴性患者。结论: 1.ERCC1和β-tubulinⅢ的表达与性别、年龄、发病部位、肿瘤大小、浸润深度、组织学分型、淋巴结转移、远处转移、TNM分期无关。 2.ERCC1和β-tubulinⅢ阴性表达者生存均优于阳性表达者。 3.ERCC1和β-tubulinⅢ的表达可以作为胃癌根治术后接受含铂类和紫杉类方案辅助化疗的预测指标。 4.ERCC1和β-tubulinⅢ共表达阴性患者生存期优于共表达阳性的患者。收起

关键词 : 胃癌 ERCC1蛋白预后因素耐药机制 &beta -tubulinⅢ蛋白

7. As<,2>O<,3>体外诱导胃癌细胞凋亡及细胞骨架改变

[学位论文] 蔡军上海交通大学 2002年硕士导师: 姜叙诚共57页

摘要 : 该研究采用:一、MTT法和细胞计数法检测As<,2>O<,3>对该细胞的生长抑制作用.结果表明:As<,2>O<,3>能抑制该细胞的增殖,并且这种抑制程度随As<,2>O<,3>作用时间延长和作用浓度增加而显著增加.倒置显微镜、光镜及透射电镜观察不同浓度As<,2>O<,3>在不同时间作用于胃腺癌细胞株8GC-7901的... 展开

关键词 : As< 2> O< 3> 细胞凋亡细胞骨架 F-actin &alpha -tubulin 胃癌

8. γ-tubulin 1促进肝癌进展的机制及对免疫微环境的影响研究

[学位论文] 何搏南昌大学医学部 2023年博士导师: 温志立共110页

摘要 : 目的：原发性肝癌（Primary liver cancer，PLC）发病率在世界范围内居所有恶性肿瘤第六位，PLC具有高度恶性、易进展及易复发等特点，因此其死亡率在所有恶性肿瘤中高居第三位，仅次于肺癌与结直肠癌。而在我国，由于存在庞大基数的乙肝感染患... 展开目的：原发性肝癌（Primary liver cancer，PLC）发病率在世界范围内居所有恶性肿瘤第六位，PLC具有高度恶性、易进展及易复发等特点，因此其死亡率在所有恶性肿瘤中高居第三位，仅次于肺癌与结直肠癌。而在我国，由于存在庞大基数的乙肝感染患者，PLC发病率在所有恶性肿瘤中居第四位，其致死率则高居肿瘤致死的第二位，对我国人民的生命健康及幸福生活构成了严重威胁。虽然得益于临床医生与研究者的共同努力，近年来肝癌的诊疗取得了长足的进步，但肝癌患者，尤其是中晚期肝癌患者的总体长期生存情况与生活质量仍不容乐观，有研究表明我国肝癌患者的5年平均生存率仅为12.1%，明显低于胃癌、肠癌等其他消化系统肿瘤。HCC治疗所面临的困境与其作为一种高度异质性的恶性肿瘤，其发生与发展的机制在很大程度上尚不清楚密切相关，如其增殖及免疫微环境的调节因素，因此深入的探究HCC发生发展中的复杂机理，对于寻找肝癌新的治疗靶点及从所有患者中筛选出可能从免疫治疗中获益的人群具有重大意义。γ-tubulin1是人类微管蛋白家族的一员，其同家族的α及β微管蛋白是临床广泛使用的化疗药物靶点之一，具有较好的抗肿瘤作用；γ-tubulin是微管组织中心的重要组成成分，可以调控细胞周期的进展且与中心体关系密切，既往许多研究已经表明中心体的扩增与肿瘤组织学分级较高、淋巴结转移及预后不良密切相关，中心体的异常可导致染色体的不稳定，是癌症的重要特征之一。有研究报道γ-tubulin1可能在非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）向肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的发展中发挥了重要作用，我们通过对TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库所有肿瘤的泛癌分析发现γ-tubulin1mRNA在HCC及肝内胆管细胞癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）中表达差异最为明显。以上研究提示γ-tubulin1可能在肝癌的发生发展中具有重要作用，是肝癌的潜在治疗靶点。但截止本文着笔，γ-tubulin1在肿瘤方面的研究仍较少，γ-tubulin1在肝癌发生发展中的作用仍不明确，机制仍不清楚。故本研究旨在探讨γ-tubulin1在肝癌发生发展中的作用及机制，希望为肝癌的临床诊疗提供新的理论依据和数据支撑。研究材料与方法：（一）γ-tubulin1表达与肝癌患者临床病理、预后关联及其作用机制分析 1、使用TCGA及GTEx（Genotype-Tissue Expression）-liver数据集及TIMER（Tumor Immune Estimation Resource）数据库分析γ-tubulin1mRNA在泛癌、肝癌及其对照的癌旁或正常组织中的表达；考虑到石蜡包埋肝癌组织存放多年，可能存在蛋白降解，故首先通过RT-qPCR及Western blot（WB）检测了23对新鲜肝癌及癌旁组织中γ-tubulin1mRNA与蛋白的表达，然后使用免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining，IHC）检测γ-tubulin1蛋白在83例石蜡包埋肝癌组织（部分含癌旁）中的表达。 2、收集83例肝癌患者的临床病理资料，结合免疫组化结果分析γ-tubulin1蛋白表达与肝癌患者临床病理参数的相关性；利用TCGA-LIHC（Liver hepatocellular carcinoma）数据集分析γ-tubulin1mRNA表达与肝癌患者临床病理参数的相关性。 3、收集83例病人的生存资料，分析γ-tubulin1蛋白表达与患者总生存期（overall survival，OS）的关系；使用Kaplan-Meier Plotter数据库分析γ-tubulin1mRNA表达水平与肝癌患者OS及疾病特异性生存期（Disease specific survival，DSS）的关系；对TCGA-LIHC数据集进行单因素及多因素Cox回归分析，评估γ-tubulin1高表达是否为肝癌患者预后不良的独立危险因素。（二）γ-tubulin1通过PI3K/AKT通路调控肝癌进展 1、RT-qPCR及WB检测γ-tubulin1在肝癌细胞系及人正常肝细胞系中的表达；依据结果选择选择表达最高的7721细胞系转染siRNA，表达中等的LM3细胞系同时转染过表达慢病毒及siRNA以构建γ-tubulin1稳定过表达及敲减细胞株，RT-qPCR及WB检测过表达及沉默效率。 2、通过CCK-8、EdU、克隆形成、Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞术、Transwell迁移及侵袭实验检测过表达及敲低γ-tubulin1对肝癌7721及LM3细胞系增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响；预实验显示差异基因富集分析所提示的通路中PI3K/AKT通路变化最为明显，WB检测γ-tubulin1过表达及敲低肝癌细胞系中PI3K/AKT通路的活化情况。结果：（一）γ-tubulin1表达与肝癌患者临床病理、预后关联及其作用机制分析 1、泛癌中，相较于对应的非肿瘤组织，γ-tubulin1mRNA在多种肿瘤中显著高表达且在HCC及ICC中的表达差异居所有肿瘤之最；TCGA-LIHC-GTEx联合及TCGA-LIHC配对样本中γ-tubulin1mRNA亦显著高表达；23例新鲜肝癌组织中γ-tubulin1mRNA及蛋白表达显著高于癌旁组织，83例石蜡包埋肝癌组织中γ-tubulin1蛋白表达明显高于癌旁组织。 2、γ-tubulin1蛋白表达水平与肝癌患者的T stage、TNM stage、Grade、Microvascular invasion、AFP（≥400ng/mL）显著相关，而与Age、Gender、Tumor Encapsulation、Tumor number、NAFLD及Hepatitis B history无显著相关性。γ-tubulin1mRNA的表达水平与肝癌患者的Grade、BMI（kg/㎡）、Prothrombin time、T stage、TNM stage及AFP（≥400ng/mL）显著相关。 3、γ-tubulin1蛋白高表达与肝癌患者的OS缩短显著相关，γ-tubulin1mRNA高表达患者的OS及DSS均较低表达患者显著缩短；γ-tubulin1高表达是肝癌患者预后不良的独立危险因素，γ-tubulin1高表达预示着更差的OS。（二）γ-tubulin1通过PI3K/AKT通路调控肝癌进展 1、γ-tubulin1在5株肝癌细胞系中的表达水平均显著高于人正常肝细胞系；RT-qPCR及WB实验结果表明γ-tubulin1稳定过表达的LM3细胞系及γ-tubulin1敲低的7721与LM3细胞系均构建成功；整体水平、DNA复制活跃程度及克隆形成能力三个方面均表明γ-tubulin1过表达显著促进了肝癌细胞的增殖，同时抑制了其凋亡，敲低则显著抑制了肝癌细胞的增殖并促进了其凋亡，γ-tubulin1过表达也显著促进了肝癌细胞的迁移侵袭能力，敲低则抑制其迁移侵袭能力。 2、WB检测结果显示过表达γ-tubulin1后，P-PI3K/PI3K及P-AKT/AKT比例明显升高，通路被激活；敲低γ-tubulin1的表达后，P-PI3K/PI3K及P-AKT/AKT比例明显降低，通路被抑制。结论： 1、γ-tubulin1在肝癌组织中显著高表达且与肝癌患者关键临床病理指标恶化及预后不良密切相关；DNA拷贝数增加及启动子甲基化水平降低可能是γ-tubulin1在肝癌中高表达的重要机制。 2、γ-tubulin1高表达促进了肝癌细胞的体内外增殖以及迁移、侵袭能力，抑制了肝癌细胞凋亡，PI3K/AKT通路是γ-tubulin1调控上述表型的重要机制。 3、γ-tubulin1高表达可能通过某种机制促进了MDSCs向肝癌组织浸润，同时抑制了CD8+T浸润，从而促进了肝癌免疫抑制性微环境的形成。 4、γ-tubulin1可能参与了肝癌干性特征的维持，是肝癌潜在的新型干性标志物。 5、γ-tubulin1是肝癌潜在的治疗靶点与免疫治疗疗效预测标志物。收起

关键词 : 肝癌 &gamma -tubulin 1蛋白病理进程恶性表型免疫微环境

9. PRC17癌蛋白与beta微管蛋白相互作用的初步鉴定

[学位论文] 武慧娟东南大学 2009年硕士导师: 沈传陆共44页

摘要 : 目的： PRC17是个新近发现的癌基因，在多种肿瘤组织和细胞株中高表达。明确PRC17与β-微管蛋白之间的相互作用将有助于阐明PRC17的功能和其导致细胞恶性转化的机制，为肿瘤的早期诊断和防治提供新思路。方法：为初步鉴定PRC17癌蛋... 展开目的： PRC17是个新近发现的癌基因，在多种肿瘤组织和细胞株中高表达。明确PRC17与β-微管蛋白之间的相互作用将有助于阐明PRC17的功能和其导致细胞恶性转化的机制，为肿瘤的早期诊断和防治提供新思路。方法：为初步鉴定PRC17癌蛋白与细胞骨架蛋白β-微管蛋白之间的相互作用，我们首先将HA-pGEX-6P-1，GST-HA-PRC17/pGEX转导入大肠杆菌BL21后，经丙醇-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）大量诱导表达GST-HA和GST-HA-PRC17融合蛋白后，在非变性条件下（1%NP40裂解液和超声破碎仪裂解细菌菌体）用Glutathione Sepharose4B对GST-HA和GST-HA-PRC17蛋白分别进行了亲和纯化。以GST-HA蛋白为对照，用GST-HA-PRC17融合蛋白与HeLa细胞裂解物进行GST pull-dwon分析，用抗β微管蛋白抗体进行Western Blot分析以检测沉淀中的β微管蛋白。为进一步研究PRC17癌蛋白与细胞骨架蛋白β-微管蛋白之间的相互作用，通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增出人β-微管蛋白2C（beta tubulin2C，TubB2C）基因完整开放读码框架（Open reading frame，ORF），并插入pGEX-6P-1载体中构建pGEX-TubB2C重组质粒。将pGEX-6P-1和pGEX-TubB2C质粒分别转导入大肠杆菌BL21，并经IPTG大量诱导表达GST和GST-TubB2C蛋白后，在非变性条件下用Glutathione Sepharose4B对GST和GST-TubB2C蛋白分别进行了亲和纯化。用真核表达质粒HA-PRC17/pcDNA3转染培养的MCF-7细胞，以GST蛋白为对照，将纯化的GST-TubB2C蛋白与该转染细胞裂解物进行GST pull-down分析，用抗HA抗体进行Western Blot分析，以检测沉淀中的HA-PRC17蛋白。结果：分别用GST-HA蛋白表达质粒HA-pGEX-6P-1和GST-HA-PRC17融合蛋白表达质粒GST-HA-PRC17/pGEX转化大肠杆菌BL21后，经IPTG诱导表达的蛋白分子量均符合预期，约为29．04 kDa（GST-HA蛋白）和90．4 kDa（GST-HA-PRC17融合蛋白），而未转入任何质粒的BL21阴性对照，则在相应分子量处仅见较弱的非特异性蛋白条带。以GST-HA蛋白为对照，用GST-HA-PRC17融合蛋白与HeLa细胞裂解物进行GST pull-dwon实验后，用抗B微管蛋白抗体进行Western Blot分析，显示PRC17蛋白与β微管蛋白结合，而对照GST-HA蛋白并不结合β微管蛋白，证实PRC17蛋白可特异性结合β微管蛋白。构建的GST-TubB2C融合蛋白原核表达质粒pGEX-TubB2C分别经BamHⅠ单酶切、EcoRⅠ和xhoⅠ双酶切后出现1045 bp和1345 bp的特征性片段，TubB2C cDNA序列经测序证实无误。大肠杆菌BL21在分别用pGEX-TubB2C和pGEX-6P-1转化后，由IPTG诱导表达的蛋白分子量均符合预期，为78 kDa（GST-TubB2C融合蛋白）和28．4 kDa（GST蛋白），而未转入任何质粒的BL21阴性对照，则在相应分子量处仅见非常弱的非特异性蛋白条带。Western Blot分析结果显示抗GST抗体可特异性识别GST-TubB2C蛋白，但不能识别阴性对照的非特异性蛋白。在非变性条件下（1%NP40裂解液和超声破碎仪裂解细菌菌体），GST-TubB2C和GST蛋白用Glutathione Sepharose4B进行了初步亲和纯化且GST-TubB2C蛋白纯度估计可达90%以上。以GST蛋白为对照，用GST-TubB2C融合蛋白与经HA-PRC17/pcDNA3转染的MCF-7细胞裂解物进行GST pull-dwon实验后，用抗HA抗体进行Western Blot分析，显示TubB2C蛋白与PRC17结合，而阴性对照GST蛋白并不能显著结合PRC17蛋白，表明TubB2C蛋白可特异性结合PRC17。结论： PRC17癌蛋白能特异性结合β-微管蛋白2C。收起

关键词 : PRC17癌蛋白 &beta -微管蛋白蛋白相互作用 GSTPull-down &beta -Tubulin 基因诊断

10. 进展期非小细胞肺癌β-tubulinⅢ和Stathmin的表达及与多西他赛化疗耐药性关系的研究

[学位论文] 王秀丽新疆医科大学 2013年硕士导师: 张国庆共70页

摘要 : 目的：探讨晚期非小细胞肺癌组织中β-tubulinⅢ、stathmin蛋白表达情况，分析其与多西他赛耐药性及预后的关系。方法：本研究为前瞻性研究，选取2007年10月-2012年8月经新疆医科大学附属肿瘤医院内科收治经组织病理学学确诊为鳞癌的晚期或复发性... 展开

关键词 : 非小细胞肺癌 &beta -tubulinⅢ蛋白 Stathmin蛋白多西他赛化疗耐药性