摘要: 恶性肿瘤严重威胁人类生命健康。肿瘤免疫治疗虽然在血液肿瘤中展现出较好的临床疗效，但在实体肿瘤中疗效有限。实体肿瘤形成营养匮乏的肿瘤微环境是抑制抗肿瘤免疫反应的重要原因之一。谷氨酰胺作为人体重要的营养物质，在肿瘤细胞中谷氨酰胺酶（Gl... 展开 恶性肿瘤严重威胁人类生命健康。肿瘤免疫治疗虽然在血液肿瘤中展现出较好的临床疗效，但在实体肿瘤中疗效有限。实体肿瘤形成营养匮乏的肿瘤微环境是抑制抗肿瘤免疫反应的重要原因之一。谷氨酰胺作为人体重要的营养物质，在肿瘤细胞中谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS）参与下被转化为谷氨酸，参与核苷酸、氨基酸、脂肪酸和抗氧化剂谷胱甘肽的合成。谷氨酰胺代谢在调节肿瘤细胞的生长、增殖、转移和耐药性等多个方面发挥着重要作用。此外，谷氨酰胺代谢对于调节浸润淋巴细胞（TILs）的分化和功能也具有重要作用。在营养匮乏的肿瘤微环境中，肿瘤细胞和免疫细胞对谷氨酰胺需求的高度一致性可能会引起竞争谷氨酰胺。已有研究表明，谷氨酰胺的减少会对肿瘤内免疫细胞功能产生负面影响。抑制肿瘤的谷氨酰胺代谢抑制肿瘤细胞的发展并增强淋巴细胞的抗肿瘤功能，是一种有前途的治疗策略。 目的： 本课题旨在探究谷氨酰胺代谢对肿瘤进展和淋巴细胞抗肿瘤功能的影响及其机制，为肿瘤干预策略提供新靶点。 方法： 1. 分析降低肿瘤GLS表达对肿瘤增殖的影响：体外构建GLS表达降低MC38细胞系模型（GLSKD），同时建立体内裸鼠肿瘤模型和 C57BL/6 小鼠肿瘤模型，肿瘤组织制作冷冻切片。流式细胞术检测降低GLS表达后，MC38细胞系核增殖抗原Ki67表达情况；免疫荧光检测裸鼠和C57BL/6小鼠肿瘤组织核增殖抗原Ki67平均荧光强度。 2. 分析降低肿瘤GLS表达对肿瘤凋亡的影响：AnnexinV-7AAD染色检测降低GLS表达后，MC38细胞系凋亡情况；免疫荧光检测裸鼠和C57BL/6小鼠肿瘤组织凋亡相关抗原Caspase3平均荧光强度。 3. 探究降低肿瘤GLS表达对抗肿瘤免疫的影响：提取上述C57BL/6小鼠肿瘤模型TILs，检测肿瘤部位淋巴细胞（TILs）数量和CD8+T淋巴细胞耗竭分子PD-1等的表达情况。 4. 探究谷氨酰胺对 CD8+T 淋巴细胞功能的影响：构建不同浓度谷氨酰胺（Glutamine，GLN）的条件培养基，用完全培养基（Complete medium，2mM）和条件培养基分别处理健康志愿者来源的PBMCs或者分离的CD8+T细胞。使用CCK8检测CD8+T细胞活率；使用流式细胞术检测CD8+T细胞活化蛋白CD137、脱颗粒蛋白CD107a表达情况和分泌IFNγ情况。 5. 探究谷氨酰胺调节 CD8+T 淋巴细胞功能的机制：完全培养基和无谷氨酰胺培养基活化CD8+T淋巴细胞：转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）分析无谷氨酰胺培养后，CD8+T淋巴细胞基因表达情况；脂质活性氧探针检测CD8+T淋巴细胞脂质过氧化情况；流式细胞术检测CD8+T淋巴细胞谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达情况，评价CD8+T淋巴细胞铁死亡敏感性。在完全培养基中加入GPX4抑制剂(1S,3R)-RSL3（RSL3）作为阳性对照或在无谷氨酰胺培养基中加入谷胱甘肽（Glutathione，GSH）：脂质活性氧探针检测CD8+T淋巴细胞脂质过氧化情况；流式细胞术检测CD8+T淋巴细胞谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达情况，CCK8检测CD8+T淋巴细胞活率；流式细胞术检测CD8+T淋巴细胞IFNγ分泌情况，探究铁死亡对CD8+T淋巴细胞功能的影响。 6. 探究谷氨酰胺转运蛋白抑制剂 V-9302 对肿瘤生长和淋巴细胞抗肿瘤功能的影响：V-9302处理MC38细胞系和CD8+T细胞：CCK8检测MC38细胞系和CD8+T细胞活率；V-9302处理PBMCs：流式细胞术检测CD8+T细胞活化蛋白CD137表达情况和IFNγ分泌情况。构建C57BL/6小鼠MC38肿瘤模型，腹腔注射PBS或V-9302，记录肿瘤生长，收集肿瘤组织并提取肿瘤浸润T淋巴细胞，分析免疫细胞浸润情况，检测 CD8+T淋巴细胞分泌细胞因子情况。 结果： 1. 分析降低肿瘤GLS表达对肿瘤增殖的影响：与MC38野生型细胞系（GLSWT）相比，GLSKD细胞系：体外核增殖抗原Ki67表达降低；裸鼠和C57BL/6小鼠肿瘤组织核增殖抗原Ki67平均荧光强度降低。 2. 分析降低肿瘤GLS表达对肿瘤凋亡的影响：与MC38野生型细胞系（GLSWT）相比，GLSKD细胞系：体外不发生凋亡；裸鼠肿瘤组织Caspase3平均荧光强度无差异，C57BL/6小鼠肿瘤组织Caspase3平均荧光强度显著增高。分析发现：免疫细胞参与下，降低GLS表达会促进肿瘤凋亡。 3. 探究降低肿瘤GLS表达对抗肿瘤免疫的影响：与GLSWT肿瘤相比，GLSKD肿瘤部位TILs数量增加且CD8+T淋巴细胞耗竭分子PD-1等表达降低。 4. 探究谷氨酰胺对CD8+T淋巴细胞功能的影响：谷氨酰胺浓度降低后，CD8+T淋巴细胞的活率降低，活化蛋白CD137、脱颗粒蛋白CD107a表达降低，分泌IFNγ水平降低。 5. 探究谷氨酰胺调节 CD8+T 淋巴细胞功能的机制：RNA-seq 结果显示：无谷氨酰胺培养增强了 CD8+T 淋巴细胞半胱氨酸代谢和铁死亡等过程；无谷氨酰胺培养降低 CD8+T淋巴细胞 GPX4 表达，提高脂质过氧化水平；无谷氨酰胺培养时外源补充GSH提高CD8+T淋巴细胞GPX4表达，降低脂质过氧化水平；铁死亡降低CD8+T淋巴细胞活率，抑制其IFNγ分泌水平。 6. 探究谷氨酰胺转运蛋白抑制剂 V-9302 对肿瘤生长和淋巴细胞抗肿瘤功能的影响：体外实验表明：V9302可以降低肿瘤活率，不损害CD8+T淋巴细胞活率、活化和IFNγ分泌功能。体内实验表明：V9302可以抑制肿瘤生长，提高肿瘤部位CD4+T和CD8+T淋巴细胞比例，提高CD8+T淋巴细胞GPX4的表达，增强CD8+T淋巴细胞分泌细胞因子的能力。 结论： 本研究发现肿瘤对微环境中谷氨酰胺的摄取和代谢会诱导浸润CD8+T淋巴细胞发生铁死亡并抑制其抗肿瘤功能。抑制肿瘤谷氨酰胺代谢可以抑制肿瘤生长，改善淋巴细胞浸润状态并增强其抗肿瘤功能。本研究提示抑制肿瘤谷氨酰胺代谢是一种有效的肿瘤治疗策略。 收起