摘要: 研究目的 近年来，随着SARS-CoV-2的流行，流感病毒越来越受到人们的关注。甲型流感病毒因为对人类的高致病性特点，曾多次引起世界性大流行。鼻腔黏膜是对抗甲型流感病毒的第一道屏障，然而目前对于甲型流感病毒感染导致鼻腔黏膜炎症的具体机制尚... 展开 研究目的 近年来，随着SARS-CoV-2的流行，流感病毒越来越受到人们的关注。甲型流感病毒因为对人类的高致病性特点，曾多次引起世界性大流行。鼻腔黏膜是对抗甲型流感病毒的第一道屏障，然而目前对于甲型流感病毒感染导致鼻腔黏膜炎症的具体机制尚不清楚。最近的研究表明，铁死亡可能是病毒感染诱导炎症的根源，且NRF2基因可以通过调节细胞抗氧化水平来调节病毒介质的表达和病毒进入细胞的水平。因此，为了探究甲型流感病毒感染鼻腔黏膜的确切机制，我们使用H1N1病毒和分化的人鼻黏膜上皮细胞来寻找关键的调节基因。此外，研究发现L-谷氨酰胺(Glutamine,Gln)在胱氨酸饥饿条件下通过谷氨酰胺分解途径诱导铁死亡。谷氨酰胺酶在铁死亡驱动的疾病中起到关键作用，被认为是一个潜在的治疗靶点。因此，我们通过研究病毒诱导鼻粘膜损伤的机制，为病毒诱导的炎症寻找新的、有吸引力的治疗靶点。 研究方法 1、鼻黏膜上皮原代细胞(humannasalepithelialprogenitorcells,hNEPCs)的培养,鼻中隔黏膜组织被胰酶消化后于滋养层细胞NIH3T3上培养出鼻黏膜上皮干细胞，然后通过3D气液面培养获得分化的鼻黏膜上皮细胞(humannasalepithelialcells,hNECs)。 2、H1N1病毒感染鼻黏膜上皮细胞模型的建立，将扩增的H1N1病毒与鼻黏膜上皮细胞在37℃下孵育2小时。然后去除病毒接种物后在37℃下培养，并根据后续的培养时间分为Oh组，8h组，24h组和48h组。 3、流式细胞术观察病毒刺激后细胞的活性。使用MTT法测量应用铁死亡抑制剂ferrostatin-1,deferoxamine(DFO)和α-Tocopherol;细胞凋亡抑制剂:Z-VAD-FMK;细胞坏死抑制剂:Necrostatin-1的病毒刺激后鼻黏膜上皮细胞的活性变化。 4、通过BODYPIC11581/591进行脂质过氧化检测，使用4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE),丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)酶联免疫吸附测定试剂盒检测脂质过氧化水平。 5、RNA测序，我们对样本进行了富集分析、表达差异分析和聚类分析，筛选出病毒刺激下差异表达的基因NRF2、KEAP1和GCLC等。高通量非靶向代谢组学分析，根据病毒刺激的时间分组，根据文献鉴定代谢物，然后进行二次确认，筛选出谷氨酰胺代谢的信号通路。 6、RNA干扰和转染技术，我们采用慢病毒转染技术，将包含有ov-GCLC、sh-GCLC、sh-KEAP1、sh-SLC1A5的慢病毒和相应的阴性对照慢病毒与鼻黏膜上皮细胞共培养，并用WB观察干扰效率。 7、H1N1病毒感染小鼠模型的建立，将病毒液通过滴鼻途径感染小鼠，对照组给予生理盐水滴鼻。实验组的小鼠通过腹腔注射JHU-083的方式给药，对照组则腹腔注射同等量的生理盐水。 研究结果 1、H1N1流感病毒感染鼻黏膜上皮细胞诱导铁死亡发生。我们观察到的鼻黏膜上皮细胞的活性随着H1N1病毒滴度的增加而下降，病毒感染模型建立成功。我们同时发现与其他细胞死亡抑制剂相比，ferrostatin-1显著减轻了甲型流感病毒诱导的细胞死亡。且应用ferrostatin-1后病毒刺激的鼻黏膜上皮细胞铁死亡水平明显降低。 2、NRF2-KEAP1信号通路调节H1N1病毒感染鼻黏膜上皮细胞诱导的铁死亡。通过RNA测序结果观察到铁死亡相关基因在病毒刺激前后表现出明显差异，进行基因本体富集分析以比较与铁死亡相关的几个重要基因的相互关系。我们进一步分析了获得的差异基因，筛选了NRF2,KEAP1和GCLC三个基因。我们发现在敲低KEAP1后，鼻黏膜上皮细胞的铁死亡水平在病毒的刺激下显著降低，铁死亡相关标记分子Ptgs2、TfR1、CHAC1、ACSL的转录降低，而GPX4和SLC7A11的转录增加。 3、H1N1病毒感染的鼻黏膜上皮细胞诱导L-谷氨酰胺代谢重编程。代谢组学筛选出差异代谢物为谷氨酰胺，酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedImmunosorbentassay,ELISA)检测发现在病毒刺激的鼻黏膜上皮细胞中，谷氨酰胺及其代谢物α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,AKG)和NADPH增加，施用ferrostatin-1后，谷氨酰胺及其代谢物减少。 4、GCLC可能参与调节H1N1病毒感染的鼻黏膜上皮细胞中的铁死亡。通过慢病毒过表达GCLC,检测鼻黏膜上皮细胞的活性明显升高，铁死亡水平明显降低，铁死亡相关标记分子Ptgs2、TfR1、CHAC1、ACSL的转录降低，而GPX4和SLC7A11的转录增加。这些变化证实了NRF2-KEAP1-GCLC信号通路参与hNECs的铁死亡。 5、JHU-083减轻H1N1感染诱导的小鼠免疫系统损伤。我们观察病毒刺激的小鼠模型，在腹腔注射JHU-083后，小鼠的炎症指标降低，且通过观察谷氨酰胺水平，发现JHU-083可通过谷氨酰胺代谢途径减少H1N1病毒对机体的损伤。 研究结论 H1N1流感病毒可通过鼻黏膜上皮细胞中的NRF2-KEAP1-GCLC信号通路诱导铁死亡。此外，H1N1流感病毒通过引起鼻黏膜上皮细胞的谷氨酰胺代谢重编程来促进铁死亡。我们的实验证明，JHU-083通过抑制H1N1病毒引起的铁死亡，可以降低鼻腔炎症的严重程度。 收起