摘要: 抗生素的使用极大提高了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）及大肠埃希菌（Escherichia coli, E. coli）等病原菌所致感染及炎症的治愈率。然而，抗生素的滥用导致了耐药性细菌的出现，单独使用一种抗生素也远达不到良好治疗效果。因... 展开 抗生素的使用极大提高了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）及大肠埃希菌（Escherichia coli, E. coli）等病原菌所致感染及炎症的治愈率。然而，抗生素的滥用导致了耐药性细菌的出现，单独使用一种抗生素也远达不到良好治疗效果。因此，急需寻求不易产生耐药性且抗菌谱较广的天然抗菌物质，制定两种或多种药物联合抗菌方案以提高单药抗菌性能。红豆杉作为一种天然珍稀植物，其不同部位（枝叶、树皮和根）中活性成分（紫杉烷二萜类、多糖类和甾体类等）具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药理作用，而种子作为红豆杉重要部位，对其活性成分抗菌筛选研究却不多。 研究目的： 本课题旨在选取重庆巴南区的南方红豆杉（Taxus wallichiana var. mairei, T. wallichiana var. mairei）种子，探究其中活性成分对 S. aureus（CMCC26003）与 E. coli （ATCC25922）抑制作用，制备纳米胶束提高各抗菌成分的溶解度，综合筛选最优抗菌成分，并与小檗碱（berberine, BBR）、青霉素钠（penicillin sodium, PG）和阿莫西林胶囊（amoxilin capsule, AMO）进行联合抗菌，探讨药物之间相互作用并进一步观察其动态杀菌效果。最后，将制备红豆杉种子抗菌手工皂，初步对天然抗菌产品进行探索。这可能为天然物质的抗菌筛选提供研究思路，为天然红豆杉抗菌产品的研发提供理论基础。 研究方法： 首先，将乙醇作为提取溶剂对红豆杉种子进行加热回流超声提取，以石油醚对红豆杉种子粗提液进行萃取，并通过单因素法考察乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间和提取次数对红豆杉种子粗提物得率影响，筛选最优提取工艺；通过AB-8型大孔吸附树脂（macroreticular resin, MAR）对红豆杉种子粗提物进行分离；为提高AB-8型MAR分离部位（简称AB-8部位）溶解度，通过薄膜分散法制备聚合物胶束，以单因素法筛选最优处方，并对其进行体外评价；采用微量肉汤稀释法（microbroth dilution method, MBD）测定AB-8部位及其聚合物胶束对S. aureus与E. coli的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）以综合筛选最优抗菌部位。其次，通过柱层析法，以硅胶（silica gel, SG）为填料，以二氯甲烷与甲醇混合溶剂为洗脱液进行纯化，将获得不同组分继续进行抗菌筛选，追踪 SG 最优抗菌组分，通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）与液质联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）技术对其进行成分分析；为提高药物的溶解度和抗菌性能，通过薄膜分散法制备纳米混合胶束，以单因素法筛选最优处方，并对其进行体外评价。同时，将斑马鱼作为模式生物对红豆杉种子样品（AB-8 最优抗菌部位及其聚合物胶束与 SG 最优抗菌组分及其纳米混合胶束）进行 72 h 急性毒性评价。另外，为探究红豆杉种子样品分别与 BBR、PG、AMO 的联合抗菌效果，采用微量棋盘法进行联合药敏试验，并通过部分抑菌浓度指数（fraction inhibitory concentration index, FICI）判断药物之间联合效应；采用时间-杀菌曲线（time-killing curve）法观察各联用组0~24 h动态杀菌效果。最后，选择橄榄油、椰子油及AB-8最优抗菌部位聚合物胶束制备红豆杉种子抗菌手工皂，以不同指标对其进行一系列质量评价。 研究结果： 首先，最佳提取工艺为：乙醇浓度：60%、料液比：2:25、提取温度：70℃、提取时间：6 h、提取次数：3次；获得不同极性AB-8部位为A-1、A-2、A-3、A-4、A-5；为提高A-2~A-5的溶解度，成功制备A-2~A-5聚合物胶束（A-2-PM~A-5-PM）；在一定浓度范围内，综合筛选了 A-1~A-5及 A-2-PM~A-5-PM的抗菌活性，明确了 A-5为最优抗菌部位；A-5-PM 最优处方是 A-5、F68 和 F127 分别为 9 mg、4 mg 和 32 mg；该胶束粒径（partical size, PS）为 23.26±0.12 nm，多分散指数（polydispersion index, PDI）为0.139±0.005，ζ 电位（zeta potential, ZP）为-19.25±0.15 mV；临界胶束浓度（critical micelle concentration, CMC）为7.59×10-2 mg/mL；包封率（encapsulation efficiency, EE）和载药量（drug loading, DL）为95.87%±0.08%和18.53%±0.01%；在7天内稳定性良好。其次，对A-5继续进行纯化，共获得10个组分（A5-1~A5-10），经抗菌筛选确定A5-4与A5-8为SG最优抗菌组分；空白纳米混合胶束（B-MM）最优处方是卵磷脂与胆酸钠均为10 mg，PVP K30为24 mg，而A5-4与A5-8纳米混合胶束（A5-4-MM与A5-8-MM）的最佳载药量均为5 mg；A5-4-MM与A5-8-MM的PS分别为135.43±0.04 nm和105.73±0.08 nm，PDI分别为0.204±0.002和0.203±0.002，ZP分别为-14.73±0.12 mV和-12.65±0.08 mV， CMC 为 1.98×10-2 mg/mL，具有较高的 EE（83.67%±0.07%和 88.33%±0.06%）和 DL （8.53%±0.05%和8.64%±0.01%），在7天内均有良好的稳定性；经分析A5-4可能包含紫杉醇与三尖杉宁碱等10种物质，A5-8中有紫杉醇在内等5种物质。同时，斑马鱼急性毒性结果表明A-5、A-5-PM、B-MM、A5-4、A5-4-MM、A5-8、A5-8-MM、BBR的IC50值分别是29.49、58.03、48.07、26.50、24.71、23.23、17.67、10 μg/mL，其中A-5-PM毒性最小，A5-4-MM与A5-8-MM可能受胆盐影响，其毒性略高于A5-4与A5-8。另外，联合药敏试验结果表明联用组抗菌活性更强，可明显降低药物单用MIC；除A-5与BBR联合抗 S. aureus 呈相加作用外，其余联用组均呈显著协同抗菌作用；在此基础上，各联用组动态杀菌效果明显高于其单用组，尤其是纳米胶束与抗生素联合抗菌作用，且药物相互作用与联合药敏试验结果基本保持一致。最后，红豆杉种子抗菌手工皂最佳配方是：橄榄油12 g，椰子油8 g，NaOH为3.13 g，A-5-PM（A-5：0.20 g）溶液为7.82 mL；质量评价结果表明：该皂成型较好、皂体光滑且硬度适宜；对皮肤刺激较小；水分及挥发物、总游离碱及氯化物含量均符合相关行业标准；冷稳定性较热稳定性更好；具有良好的抗菌活性，尤其是对S. aureus抑制作用。 研究结论： 天然红豆杉种子中的活性成分对S. aureus及E. coli均有良好的抑制作用，最优抗菌成分为A-5、A5-4和A5-8，其纳米胶束载药系统能成为提高药物溶解度并提升原药抗菌性能的优秀递送体系。而且，红豆杉种子样品与阳性药（尤其是抗生素）联用后极大提高了抗菌性能，这可能将减少抗生素用量，从而减少细菌耐药情况的发生。最后，成功制备了红豆杉种子抗菌手工皂，这将为红豆杉抗菌产品的开发奠定基础，为天然抗菌物质的利用提供新思路。 收起