摘要: 研究目的： 癌症依然是当今人类健康面临的重大难题，目前的治疗手段主要包括放射治疗、免疫治疗、手术切除和化学治疗等。其中化疗对处于早中晚期的癌症患者均有一定疗效，常与其他手段联合治疗，是一种癌症治疗的常用策略，然而化疗药物的毒性也... 展开 研究目的： 癌症依然是当今人类健康面临的重大难题，目前的治疗手段主要包括放射治疗、免疫治疗、手术切除和化学治疗等。其中化疗对处于早中晚期的癌症患者均有一定疗效，常与其他手段联合治疗，是一种癌症治疗的常用策略，然而化疗药物的毒性也是有目共睹，因此寻找抗肿瘤效果更好且毒性更低的化疗药物成为关键。天然植物被认为是具有生物活性化合物来源的丰富储库。据研究显示，红豆杉具有多种药理活性，其中以抗肿瘤效果最为明显。红豆杉的种子具有丰富的资源和良好的抗肿瘤活性。因此，聚焦红豆杉种子筛选理想的抗癌活性物质是一条有效途径。聚合物胶束在抗癌药物发展中展现出多种优越性能，如增溶、提高靶向性、降低毒性、提高生物利用度，增强抗肿瘤效果等，将天然产物经聚合物胶束递送至体内能极大地发挥抗癌药物的疗效。因此本研究以红豆杉种子为原材料，从中筛选出抗肿瘤效果好且毒性相对低的抗癌活性成分，并通过聚合物胶束将其进行递送，以期望能提高抗肿瘤效果并降低毒性。 方法及结果： 1. 利用有机溶剂萃取，硅胶柱层析、薄层层析等分离纯化手段，结合MTT法从红豆杉种子乙醇提取物中筛选得到抗肿瘤活性单体化合物和部位。采用多种分析技术鉴定该化合物为蜕皮激素（EC）。采用MTT法评估EC及EC含量较高部位（BE）的抗肿瘤活性，结果表明，EC对A549和U251表现出较弱的抗肿瘤作用，对HepG2表现出良好的抗肿瘤效果，其半抑制浓度（IC50）为68.88μg/mL。BE对HepG2、A549和U251均具有良好的抗肿瘤效果，IC50值分别为34.34μg/mL、35.25μg/mL、61.56μg/mL。 2. 采用HPLC建立EC的体外分析方法。结果表明，EC的体外HPLC分析方法符合方法学要求，可用于红豆杉种子提取液中EC的含量检测，利用该分析方法检测BE中EC的含量为（62.00 ± 0.21）%。以EC的提取率为指标采用单因素和中心复合响应面优化BE的提取工艺。单因素结果表明最佳提取温度60℃、乙醇浓度50%、提取时间9 h、料液比1:10、提取次数1次。中心复合响应面拟合模型的P值和R2分别为0.0003和0.9147，表明该回归模型显著，能正确反映实验结果。优化后最佳提取温度70℃、乙醇浓度75%、提取时间为6 h、EC提取率为（607.74 ± 15.18）μg/g。 3. 利用HPLC成功构建BE的分析方法。结果表明，BE的HPLC分析方法符合方法学要求，可用于BE的体外定量分析。采用溶剂注入法构建BE胶束（BE-M）体系，并通过单因素实验进行优化。对最优处方进行粒径，多分散指数（PDI）、包封率、载药量、透射电镜（TEM）、临界胶束浓度（CMC），X-射线衍射分析（XRD）和傅里叶变换红外分析（FT-IR）等体外评价并在室温环境下考察其稳定性。最后用透析法考察其在盐酸水溶液（pH 1.2），磷酸盐缓冲溶液（pH 6.8）和磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）的累积释放率。单因素结果显示最佳温度50℃，转速1600 rpm/min，BE:mPEG-PCL:TPGS=10 mg:20 mg:10 mg。体外表征显示BE-M为均匀分散的球形颗粒，粒径34.37 ± 0.11 nm，PDI为0.152 ± 0.003，包封率86.53 ± 1.54%，载药量21.63 ± 0.87%。BE-M较低的CMC值（0.881μg/mL）表明具有较好的抗稀释能力。XRD和FT-IR结果表明BE被成功封装在BE-M中，即BE-M制备成功。BE-M的稳定性结果表明在室温环境下BE-M至少能保持7 d的稳定性。体外释放结果表明，BE-M在三种释放介质中释放良好，且BE-M对BE起到了一定缓释的作用。 4. 构建小鼠各组织中BE的体内HPLC检测方法并对其进行专属性评估。考察BE和BE-M在小鼠各脏器中的分布情况。采用HepG2、A549和U251肿瘤细胞评估了BE-M的抗肿瘤活性。以斑马鱼为对象考察了 BE-M 的安全性。结果表明小鼠各组织匀浆液中 BE的体内HPLC检测方法专属性良好，可用于各组织中BE的分析检测。BE-M在小鼠各组织中的分布情况表明，BE-M 能增加 BE 在各组织中的积累，以肝脏和脑部最显著。表明BE-M具有一定的肝脏靶向和脑部靶向作用。除此之外BE-M还具有延长BE 在各组织中滞留时间的作用。MTT法检测抗肿瘤结果显示，BE-M对HepG2，A549，U251的IC50值分别为25.87μg/mL、28.04μg/mL、48.54μg/mL，而BE对HepG2，A549，U251的IC50值分别为34.2μg/mL、34.98μg/mL、62.75μg/mL。表明BE-M提高了BE的体外抗肿瘤效果，体现BE-M的优越性。斑马鱼的安全性评估结果显示BE-M在第3 d对斑马鱼的半数致死浓度（LC50=219.45μg/mL）值大于BE（LC50=138.06μg/mL），表明BE-M降低了BE的毒性，安全性好。 收起