摘要: 目的: 通过星点设计-效应面优化法优选水蛭最佳提取工艺，最佳工艺所得粗提取物经过DEAE Sephadex A-50、Sephadex G-50凝胶柱层析分离纯化获取较粗提取物抗凝血活性更高的纯化产物;为水蛭有效成分制剂的进一步研究提供实验依据。 方法: 水蛭... 展开 目的: 通过星点设计-效应面优化法优选水蛭最佳提取工艺，最佳工艺所得粗提取物经过DEAE Sephadex A-50、Sephadex G-50凝胶柱层析分离纯化获取较粗提取物抗凝血活性更高的纯化产物;为水蛭有效成分制剂的进一步研究提供实验依据。 方法: 水蛭粗提取物的制备:通过星点设计-效应面优化法优选水蛭粗提取物的最佳提取工艺，以提取时间(h)，加水量（相当于药材倍数），醇沉浓度(％)，醇沉静置时间(h)为四个影响因素，共需进行2k+2×k+(2×k-1)=31次（k为因素个数）提取，同时固定水蛭粗粒的浸泡时间为4h，提取次数为三次;在进行效应面优化试验前，先进行单因素试验。依据单因素试验结果选取提取时间考察范围为0.5h～4h，加水量为4倍～12倍，醇沉浓度为40％～80％，醇沉静置时间为8h～24h。用Mini tab15.0统计软件包进行效应面设计，同时对各因素进行多元线性回归和二项模式拟合，优选最佳提取工艺。 粗提取物凝胶柱层析:粗提取物首先通过阴离子交换柱层析(DEAESephadex A-50)，分离获取抗凝血活性较水蛭粗粒强的分离产物，活性峰洗脱液透析除盐收集活性产物，最后进行Sephadex G-50进行进一步的分离纯化，进而获取较粗提取物抗凝血活性更强的活性物。 活性成分的测定:按照2010版药典水蛭项下含量测定方法凝血酶滴定法及血浆复钙时间测定粗提取物和分离纯化产物的抗凝血活性;另外采用凯氏定氮法测定粗提取物及分离产物的蛋白质含量。 结果: 1.水蛭粗提取物的最佳提取工艺 以抗凝血酶效价为指标，优选水蛭粗提取物的最佳提取工艺;通过Minitab15.0软件包的处理分析，得到最佳提取工艺参数为:提取时间为1.5h，加水量为10倍，醇沉浓度为50％，醇沉静置时间为20h。 2.粗提取物经凝胶柱层析 ①粗提取物首先通过阴离子交换层析（DEAE Sephadex A-50），通过实验考察确定所用层析柱的尺寸为30cm*1 cm，凝胶填充的高度为25cm，上样的样品浓度为106mg/ml（即相当于4g水蛭药材的含量）;在该条件下分离效果较好，分离得到3个活性峰，即为三种活性成分，测得三种活性成分中，峰1具有最高的抗凝血活性，为144.90U/g，峰2为112.84U/g，峰3为81.34U/g。 ②过DEAE Sephadex A-50的洗脱峰1过Sephadex G-50 收集过DEAE Sephadex A-50抗凝血活性最强的洗脱峰1，收集洗脱液透析除盐，透析液低温60℃真空干燥，得到峰1干燥产品;利用Sephadex G-50对峰1干燥产品进行进一步的分离纯化。利用该种凝胶进行分离纯化，也需要通过实验考察确定所用层析柱的尺寸为30cm*1 cm，凝胶填充高度为20cm，上样的样品浓度为45mg/ml，在该分离条件下，分离得到一个洗脱峰，收集洗脱峰，透析除盐，60℃低温真空干燥，得到干燥产品，测得其抗凝血酶效价为225.28U/g。 ③分离产物血浆复钙时间的测定 收集各洗脱峰，收集液透析除盐，低温60℃真空干燥，分别标记为A1、A2、 A3、 G1四种干燥产品，制备各种产品的浓度为5mg/ml，测得它们的血浆复钙时间均值分别为（294±4.2）s、(210±4.5)s、(135±3.7)s、(331±4.9)s，各样品重复测定十次，生理盐水作为空白测得为（68±4.6）s，水蛭粗提取物为（234±5.0）s，通过SPSS19.0统计软件分析，成组t检验比较分析，各产品与生理盐水空白比较，P＜0.05，差异有显著的统计学意义，均能够延长血浆复钙时间。 3.凯氏定氮法测定产品的蛋白质含量 利用凯氏定氮法测定水蛭粉、水蛭粗提取物、过DEAE Sephadex A-50活性峰A1干燥产品、过G-50活性峰G1的蛋白质含量，分别测得为57.22g/100g、72.15g/100g、96.34mg/100g、69.87mg/100g。 结论: 水提醇沉法是提取水蛭有效成分的最佳提取方法，所得粗提取物的抗凝血酶效价较其它方法的高，通过星点设计-效应面优化法获取水提醇沉的最佳提取工艺，得到抗凝血酶效价更高的粗提取物;所得粗提取物能够有效的经过DEAESephadex A-50凝胶柱的分离纯化，所得分离产物活性峰1亦能够通过SephadexG-50的进一步分离纯化，分离得到抗凝血酶效价为112.64U/g的产物;通过水蛭粉提取液、水蛭粗提取物、过A-50/G-50的分离纯化产物的体外抗凝血活性测定的实验发现推断，水蛭起抗凝血作用的活性成分并不是单一的，而是多成分多部位共同起抗凝血作用，由此，课题组可对水蛭进行深入研究，进而分离得到多种作用部位的抗凝血活性成分，制备成各种高效的抗凝血制剂，以广泛应用于临床。 收起