摘要: 鸭短喙侏儒综合征(Shortbeakanddwarfismsyndrome,SBDS)是由新型鹅细小病毒(Novelgooseparvovirus,N-GPV)引起的一种传染性疾病。2014年以来，SBDS在我国山东、河南、安徽和江苏等主要鸭养殖区暴发，造成了严重的经济损失。该病的典型症状为短喙、舌外... 展开 鸭短喙侏儒综合征(Shortbeakanddwarfismsyndrome,SBDS)是由新型鹅细小病毒(Novelgooseparvovirus,N-GPV)引起的一种传染性疾病。2014年以来，SBDS在我国山东、河南、安徽和江苏等主要鸭养殖区暴发，造成了严重的经济损失。该病的典型症状为短喙、舌外伸和生长发育障碍，发病率通常为80％～100％,死亡率为10％～20％。骨骼作为重要的组织器官，在钙磷储存、免疫等方面发挥重要作用。骨代谢的平衡是保障鸭生长发育和生产的必要前提，由负责骨形成的成骨细胞和骨吸收的破骨细胞的共同维持。此前的研究报道显示，N-GPV感染严重抑制骨骼发育，但其抑制骨骼发育的机理尚不明确，因此本研究在病原学基础上，开展了N-GPV抑制鸭骨骼发育的分子机制研究。本研究借助代谢组测序技术(LC-MS)和转录组测序技术(RNA-Seq),筛选骨骼发育相关的差异表达代谢物和基因，确定关键候选代谢物和基因，利用荧光探针检测、间接免疫荧光等分子生物学技术，探究N-GPV感染影响鸭骨骼发育的相关机制，并确定N-GPV抑制间充质干细胞(BMSC)的分子机制，为鸭短喙侏儒综合症的预防与治疗提供理论依据。研究内容主要分为以下四个方面: 1.N-GPV遗传进化特征及致病性研究 本研究分离鉴定出4株N-GPV分离株(AHDS、NMG21、SDLY、SDWF株)，序列分析结果显示，分离株与参考毒株之间的核苷酸同源性为91.8％～100％。分离株NS1和VP1蛋白区域分别鉴定出13和19个氨基酸变异位点，可能对病毒核酸的复制和致病性产生影响。遗传进化分析显示，AHDS分离株与其他三株分离株遗传演化关系较远，与JS1株、QH15株等参考毒株归于一个分支，分离毒株NGM21株、SDLY株、SDWF株之间彼此相似，与HN1P株、SD0402株等参考毒株处于同一分支，这提示与经典GPV毒株相比，N-GPV毒株已发生明显进化，形成独立的遗传进化分支。 使用NGM21毒株分别感染1日龄雏鸭和雏鹅，通过病理学、组织病理学及器官病毒载量等检测，进行N-GPV的致病性研究。雏鸭感染NGM21株后出现死亡、生长发育受阻，表现出典型的SBDS症状。感染鸭肠道黏膜出血，绒毛坏死、脱落;肝脏出血，并伴有坏死;胆囊膨大，内胆汁充盈。病毒载量结果显示，病毒可迅速进入血液循环，入侵肝脏、脾脏、肺脏、胰腺、肠道等全身各组织器官，并在其中复制。此外，雏鹅的致病性研究结果表明，N-GPV感染能够引起感染鹅肝脏肿大、出血;胆囊膨大，胆汁充盈;肠道粘膜脱落、肠壁变薄等。 以上结果表明，N-GPV的进化与变异导致其致病性的改变，N-GPV感染主要导致感染鸭生长发育障碍，肝脏、肠道等组织受损，且N-GPV能够感染雏鹅，危害水禽养殖安全。 2.N-GPV感染导致鸭骨骼代谢紊乱 N-GPV在宿主内的转录及复制造成了多种代谢物的差异表达。利用LC-MS技术，对21d感染鸭喙和胫骨内差异代谢物进行筛选和分析，结果显示，N-GPV感染引起鸭喙和胫骨内核苷酸、磷脂类、氨基酸、糖类、脂类等代谢物差异表达，其中，氨基酸和核苷酸代谢相关的代谢物差异表达最显著。KEGG代谢通路分析结果显示，差异代谢物主要涉及代谢途径、钙信号传导途径等代谢相关通路。本研究对骨骼代谢相关生化指标进行筛选，发现睾酮、雌酮等与骨骼代谢相关的激素出现显著性差异表达，这表明，N-GPV病毒感染后，可通过影响睾酮、雌酮等激素表达水平，进而影响骨骼代谢。 以上研究，明确了N-GPV感染后骨骼代谢物表达的差异变化，提示了N-GPV感染导致骨代谢紊乱的作用机制，为N-GPV导致SBDS的致病机制提供了数据支撑。 3.N-GPV对骨骼发育的影响及作用机制 本研究结果发现，N-GPV感染显著降低雏鸭骨骼指数、钙磷含量及骨密度，破坏骨骼代谢平衡，抑制骨骼发育。为探究N-GPV感染抑制鸭骨骼发育的机制，本研究以感染鸭胫骨作为研究对象，构建了雏鸭胫骨的基因表达谱，对转录基因表达谱进行注释和差异表达分析，21d和35d胫骨转录本分别得到1507个和1825个差异表达基因，主要涉及细胞生长与坏死、炎症反应、信号转导、骨骼免疫系统与发育等功能。在细胞损伤方面，差异表达基因主要涉及细胞凋亡、细胞坏死和细胞自噬，参与细胞死亡调控的主要为PI3K-Akt、ECM-receptorinteraction及NF-kappaB等信号通路。骨骼发育方面，差异表达基因主要富集于转化生长因子-β信号通路、Wnt信号传导途径、PI3K-Akt信号传导途径等信号通路。N-GPV感染后，宿主细胞主要通过Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路等进行病原识别，随后，宿主细胞通过JAK-STAT、NF-κB、IL-17等信号通路激活细胞免疫应答及炎症反应。转录组结果表明,N-GPV感染显著降低胫骨中BMP2、β-catenin、FGF2、OPG等基因的相对表达，提高了RANKL的表达及RANKL和OPG的比率，这提示N-GPV感染通过BMP/Smads信号通路、TGF-β信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、FGF信号通路等抑制成骨细胞分化,通过RANKL/RANK/OPG信号通路增强破骨细胞活性，共同抑制雏鸭骨骼发育。 以上研究，明确了N-GPV感染后与细胞损伤、骨骼发育及骨骼免疫相关基因的动态变化，在转录水平上明确了N-GPV感染抑制鸭骨骼发育的机制，为深入研究N-GPV感染后骨骼发育及宿主免疫应答反应提供数据支撑。 4.N-GPV抑制骨髓间充质干细胞增殖分化的机制研究 为了明确N-GPV抑制骨骼发育的发生机制，本研究选用骨髓间充质干细胞(BMSC)开展体外验证试验。研究发现，N-GPV感染显著降低BMSC细胞活性，导致细胞坏死与凋亡，并抑制BMSC细胞成骨分化作用。此外，N-GPV感染通过影响Wnt/β-catenin、BMP/Smads、FGF等信号通路中关键基因mRNA和蛋白水平的表达，抑制BMSC细胞的成骨分化作用，Wnt3a、BMP2和FGF2等通路激动剂的使用则明显逆转了N-GPV感染对BMSC细胞成骨分化的抑制作用，说明Wnt/β-catenin、BMP/Smads、FGF是N-GPV感染抑制BMSC细胞成骨分化的关键通路。同时，N-GPV感染BMSC细胞后，RANKL和OPG的比率显著升高，提示OPG/RANKL/RANK信号通路是N-GPV感染后抑制骨骼发育的关键通路之一。更为重要的是，我们对N-GPV感染抑制Wnt/β-catenin、BMP/Smads、FGF等信号通路的关键蛋白进行了筛选，结果表明NS1蛋白能够显著影响Wnt/β-catenin、BMP/Smads、FGF等通路关键基因的表达，进而推测其是潜在的骨骼发育抑制蛋白。 综上，本研究明确了N-GPV抑制骨骼发育的损伤机理，发现并验证了N-GPV抑制骨骼发育的分子机制，并揭示了N-GPV抑制BMSC细胞成骨分化的具体机制，为探究N-GPV的致病机制研究提供理论基础，将有利于N-GPV感染的预防与治疗。 收起