摘要: 研究背景 骨肉瘤是来源于间叶组织的一种原发性骨组织恶性骨肿瘤、它在骨恶性肿瘤中占有相当大的比重。鉴于骨肉瘤目前没有可参考的生物靶标，所以在临床诊断、治疗方案、以及判断患者的预后受到比较大的困扰，导致许多患者在明确诊断时，他的病程... 展开 研究背景 骨肉瘤是来源于间叶组织的一种原发性骨组织恶性骨肿瘤、它在骨恶性肿瘤中占有相当大的比重。鉴于骨肉瘤目前没有可参考的生物靶标，所以在临床诊断、治疗方案、以及判断患者的预后受到比较大的困扰，导致许多患者在明确诊断时，他的病程就处于中期或晚期，并且早已出现转移的情况，通过CT检查发现多数转移灶位于肺部，患者的死亡率较高。 作为内源性竞争性分子之一的circRNA、与miRNA结合后产生负调节生物作用效果，再通过ceRNA轴与mRNA靶基因相关联，可使用其稳定性下降，或翻译作用减弱。根据ceRNA调控理论，肿瘤体内circRNA、miRNA及mRNA三者之间可能在在紧密的相关作用关系，调节相应靶基因的表达，在细胞内构建新的调控网络轴，既circRNA/miRNA/mRNA轴调控网络，影响骨肉瘤恶性生物学行为，主要包括细胞增殖能力、细胞迁移，局部浸润、以及远处转移等。我们研究团队在课题研究中，通过GO数据库，circBase数据库，发现骨肉瘤细胞系芯片中circRNA_0102049的表达量显著高表达现象，再对文献进行调研我们也发现circRNA_0102049在其它肿瘤中也参与调节功能能，包括促进胰腺癌、结直肠癌增殖和转移。目前它的生物学功能在骨肉瘤中的机理还没有完全诠释。目前研究学者们已基本形成共识:circRNA是miRNA海绵分子，结合后产生相应功能，之后与下游mRNA发生不同效果，形成ceRNA网络结构调控，对骨肉瘤的产生，发展与转归形成明显生物学效应，为骨肉瘤的研究提供理论依据。 研究目的: 本课题主要研究circRNA_0102049在骨肉瘤中的表达情况，观察环状RNA特征性，通过细胞实验观察骨肉瘤中的生物学功能，分析它对骨肉瘤细胞系的生物学功能。再通过生物信息学软件预测发现miR-520g-3p可能是circRNA_0102049的下游调控靶点，同时还通过生物信息学软件预测发现miR-520g-3p下游调控靶基因PLK2，再次通过双荧光素酶报告基因试验、Pulldown实验观察到miR-520g-3p能与circRNA_0102049结合，miR-520g-3p能与PLK2结合，进一步分析miR-520g-3p生物学功能效应，深入分析探索circRNA_0102049/miR-520g-3p/PLK2网络轴对骨肉瘤相关功能调控分子机制。 研究方法: 1.通过GEO数据库下载骨肉瘤样本中不同环状RNA的表达数据。运用R-studio(R语言)在骨肉瘤中上调和在骨肉瘤中下调的差异最大的前50个circularRNA。通过在线预测工具(StarBase)和生物信息学手段TargetScan来预测对circRNA、miRNA进行PLK2相关基因。 2.对骨肉瘤细胞系及临床收集的5例骨肉瘤标本，检测骨肉瘤细胞系统及骨肉瘤组织组中circRNA_0102049的表达水平、观察circRNA_0102049的稳定性及其在骨肉瘤细胞中细胞浆和细胞核的丰度。 3.干预circRNA_0102049对143-B骨肉瘤及对MG-63骨肉瘤细胞转染效果验证，通过CCK-8实验、平板克隆实验、Transwell实验、细胞划痕观察circRNA_0102049在骨肉瘤中功能验证，采用流式检测细胞周期，观察circRNA_0102049对细胞周期的影响。 4.利用生物信息学软件预测circRNA_0102049与miR-520g-3p结合位点，miR-520g-3p与PLK2结合位点。通过双荧光素酶报告基因检测及Pulldown实验验证circRNA_0102049与miR-520g-3p、miR-520g-3p与PLK2两者的靶向结合。 5.通过RT-qPCR检测miR-520g-3p在正常骨细胞(hFOB1.19)与骨肉瘤细胞143-B、MG-63、HOS和Saos2及5对骨肉瘤在骨肉瘤组织与配对瘤旁组织中表达量。 6.miR-520g-3p功能验证:实验项目主要包含:CCK-8、平板克隆、Transwell、细胞划痕、蛋白质印迹(WB)（包括凋亡相关蛋白:Caspase-3、Bax，p53蛋白）;抗凋亡相关蛋白BCL-2蛋白。 7.在细胞水平检测circRNA_0102049对miR-520g-3p影响，及miR-520g-3p对PLK2的影响。 8.体外水平验证circ_0102049表达及表达miR-520g-3p对骨肉瘤的影响。 9.通过CCK-8实验、平板克隆、Transwell（侵袭实验）、cellhealing、蛋白质印迹-WB（相关蛋白:Caspase-3蛋白、Bax蛋白、p53蛋白、PLK2蛋白）观察circRNA_0102049/miR-520g-3p/PLK2轴对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响。 结果: 1.生信分析circRNA_0102049在骨肉瘤细胞系中高表达，通过骨肉瘤细胞系及及临床标本，验证了circRNA_0102049骨肉瘤中高表达。circRNA_0102049不被RnaseR酶消化、是环状结构，circRNA_0102049在骨肉瘤细胞中细胞浆占比较高。 2.circRNA_0102049功能:干扰circRNA_0102049后抑制骨肉瘤细胞的体外增殖，克隆数目出现明显降低、减少细胞的迁移和侵袭、细胞划痕愈合率出现明显降低、而过表达后出现相反的效果。干扰circRNA_0102049骨肉瘤细胞出现G1期比例明显增高，S期所占比率变化不大，说明被阻滞于G1期;过表达circRNA_0102049可有效地改善G1期的阻滞情况。 3.生物信息学软件预测circRNA_0102049有miR-520g-3结合位点，miR-520g-3p有PLK2结合位点。通过双荧光素酶报告基因及Pulldown实验提示:circRNA_01020494与miR-520g-3p可直接结合，miR-520g-3p有PLK2可直接结合。 4.干扰circRNA_0102049后miR-520g-3p的表达水平显著升高;过表达circRNA_0102049后miR-520g-3p的表达水平显著下降。miR-520g-3p模拟物可使PLK2水平均降低，miR-520g-3p抑制剂使PLK2的mRNA水平显著增高;免疫印迹实验得出相同的结果。 5.miR-520g-3p在骨肉瘤细胞系及骨肉瘤标本中的表达量低，通过miR-520g-3p模拟物发现出现明显降低骨肉瘤细胞，包括细胞增殖水平降低、减少克隆形成数目、减弱划痕愈合及细胞侵袭，凋亡相关蛋白(Caspase-3，Bax，p53蛋白)表达显著上调，BCL-2蛋白的表达出现明显降低;miR-520g-3p抑制物出现相反的效果。 6.体外实验:从裸鼠皮下成瘤大体上可见:sh-circ_0102049组及miR-520g-3p过表达组可显著抑制肿瘤生长;与此同时，肿瘤体积生长曲线也发现sh-circ_0102049组及miR-520g-3p过表达组较circ_0102049+sh-miR-520g-3p组、空白对照组生长速度要慢，肿瘤重量也显示相同的结果。 7.circRNA_0102049/miR-520g-3p/PLK2轴:通过CCK-8实验、平板克隆实验、Transwell（侵袭）、划痕实验:在实验组中，与NC对照组相比，干扰circRNA_0102049组能够明显的抑制骨肉瘤细胞的增殖能力(P＜0.05)，然而在miR-520g-3p抑制或者是PLK2过表达后它的增殖效应会有加强，也就是在干扰circRNA0102049出现部分逆转现象。同时PLK2干扰组与对照组相比，它的细胞增殖能力也出现明显的降低，在转染miR-520g-3pinhibitor后，它的抑制效应会有所改善，它们之间差异有统计学差异。 8.circRNA_0102049/miR-520g-3p/PLK2轴:与NC对照组蛋白的比较、凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、p53蛋白的表达量在sh-circRNA_0102049组的表达强度明显增加，在sh-circRNA_0102049&miR-520g-3pinhibitor组和sh-circRNA_0102049&PLK2组中蛋白表达水平略有上升，sh-PLK2组的凋亡蛋白水平也出现明显增加，在sh-PLK2&miR-520g-3pinhibitor组中蛋白水平略有回升。PLK2是一种抗凋亡蛋白，它的表达量与凋亡相关蛋白相反，出现明显减少的情况。 结论: 1.在骨肉瘤中circRNA_0102049表达量较高，circRNA_0102049主要是位于细胞质中，对RNaseR的消化具有抗性性，是环状结构、circRNA_0102049对骨肉瘤的生物学功能起到促进作用，包括细胞的增殖、迁移、侵袭，以及细胞周期阻滞于G1期。 2.circRNA_0102049能够直接结合miR-520g-3p，成为它的海绵体、同时还抑制miR-520g-3p的表达;miR-520g-3p可以结合PLK2，并抑制PLK2的表达。 3.miR-520g-3p骨肉瘤细胞及骨肉瘤标本低表达，miR-520g-3p抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，凋亡相关蛋白显著上调，抗凋亡相关蛋白明显抑制。 4.circRNA_0102049/miR-520g-3p/PLK2网络轴中circRNA_0102049可通过竞争性抑制miR-520g-3p间接调控PLK2的表达而影响骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。在功能上P53基因与PLK2基因是双向调节反应元件。PLk2的功能与抗凋亡蛋白Bcl-2，促进肿瘤细胞的存活和抑制肿瘤细胞的凋亡。 5.可能通过双向circRNA_0102049，PLK2靶点抑制治疗骨肉瘤。 收起