摘要: 血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成最重要的调节因子，主要由血管内皮细胞分泌，肿瘤细胞也能不同程度地分泌VEGF。VEGF必须与细胞膜表面的跨膜酪氨酸激酶受体特异性结合才能发挥促进血管生成、增加血管通透性以及肿瘤细胞侵袭、迁移等生物学效应。VE... 展开 血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成最重要的调节因子，主要由血管内皮细胞分泌，肿瘤细胞也能不同程度地分泌VEGF。VEGF必须与细胞膜表面的跨膜酪氨酸激酶受体特异性结合才能发挥促进血管生成、增加血管通透性以及肿瘤细胞侵袭、迁移等生物学效应。VEGFR2（血管内皮生长因子受体2）是血管生成过程中VEGF最重要的受体，VEGF与VEGFR2结合后启动一系列级联信号反应，进而促进血管形成。因此，VEGF/VEGFR2信号通路成为目前靶向肿瘤血管治疗的重要靶点之一。然而，既往研究发现不管是靶向VEGF的抑制剂还是单克隆抗体均未能显著延长胶质瘤患者的总体生存期。究其原因，是由于虽然靶向抑制了VEGF的表达，一定程度上抑制了VEGF依赖的肿瘤血管形成，但与此同时肿瘤的侵袭与迁移能力却明显增强，肿瘤的拟态血管(VM)形成，限制了对肿瘤细胞的杀伤作用。前期研究，发现VEGFR2在胶质瘤中尤其是胶质母细胞瘤中显著高表达，且其与胶质母细胞瘤的血管拟态形成呈正相关，与患者总体生存期呈负相关。因此，推测靶向抑制VEGFR2不仅可以阻断VEGF/VEGFR2信号通路，抑制VEGF促血管生成作用，而且还能抑制肿瘤拟态血管形成，增强抗肿瘤效应。 研究目的: 本研究旨在探讨VEGFR2表达与胶质瘤血管拟态形成以及预后的关系。进一步探讨VEGFR2单克隆抗体(MSB0254)体外对胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移、血管拟态形成的影响以及对体内移植瘤生长、血管形成的抑制作用，为VEGFR2单抗治疗胶质瘤提供实验理论依据。 研究方法: 1.运用生物信息学方法分析VEGFR2在胶质瘤中的表达水平、其与胶质瘤血管生成之间的相关性以及与胶质瘤患者预后的关系。同时，采用免疫组织化学、蛋白免疫印迹方法检测VEGFR2、VM在胶质瘤组织及胶质瘤细胞株中的表达水平。 2.采用酶联免疫结合试验(ELISA)、流式细胞技术、表面等离子共振、蛋白免疫印迹等技术测定VEGFR2单克隆抗体(MSB0254)与VEGFR2蛋白的结合能力、亲和力、与其配体VEGF-A，C，D的结合活性以及对VEGF165诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞增殖以及下游信号通路的影响。 3.通过Transwell方法检测VEGFR2单克隆抗体(MSB0254)体外对VEGFR2表达阳性胶质瘤细胞株侵袭、迁移以及血管拟态形成能力的影响。 4.构建VEGFR2表达阳性胶质瘤细胞株皮下及原位裸鼠移植瘤模型，通过核磁共振(MRI)、免疫组织化学、Kaplan-Meier生存分析等方法检测VEGFR2单克隆抗体(MSB0254)体内对移植瘤生长、拟态血管形成、肿瘤增殖、侵袭、迁移能力以及裸鼠生存期的影响。 研究结果: 1.生信分析结果显示VEGFR2在胶质瘤组织中高表达不仅与胶质瘤的恶性程度呈正相关，而且提示患者预后不良。VEGFR2表达与血管形成相关指标CD31、CD34、HIF1α、vWF表达呈正相关。对不同VEGFR2表达水平的胶质瘤组织进行基因富集分析发现VEGFR2与细胞周期信号通路、P53信号通路以及自然杀伤细胞信号通路等密切相关。免疫组化发现VEGFR2、VM在胶质瘤组织中高表达，且随着WHO分级的增高，阳性率均逐级增高，在胶质母细胞瘤中两者表达呈正相关。VEGFR2不仅表达于血管内皮细胞，也表达于少数胶质瘤细胞株及胶质瘤干细胞。 2.酶联免疫结合试验(ELISA)结果显示VEGFR2单克隆抗体(MSB0254)仅能与VEGFR2特异性结合，不能与VEGFR1和VEGFR3结合。MSB0254仅能够与人和恒河猴VEGFR2结合，不能识别大、小鼠的VEGFR2。表面等离子共振结果显示MSB0254与人、猴VEGFR2有很强亲和力，分别为1.54nM和1.45nM。酶联免疫结合试验表明MSB0254能够浓度依赖性地阻断VEGFR2与配体VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D结合，其中阻断与配体VEGF-A结合能力最强。MSB0254可以与HUVEC表面的VEGFR2特异性结合，且可以浓度依赖性地抑制VEGF-A诱导的HUVEC细胞增殖。另外，MSB0254还能够浓度依赖性地抑制VEGF-A诱导的HUVEC细胞上VEGFR2的活化以及其下游通路中ERK的活化。 3.Transwell结果显示VEGFR2单抗(MSB0254)体外能够显著抑制VEGFR2阳性胶质瘤细胞株U251、原代胶质母细胞瘤细胞株(N13002)侵袭及迁移能力。同时，能显著抑制U251体外血管拟态形成能力。 4.VEGFR2单抗(MSB0254)可以显著抑制裸鼠皮下移植瘤及原位移植瘤的生长，降低肿瘤增殖、侵袭、迁移以及拟态血管形成能力，对裸鼠总体生存期有一定程度地改善。 研究结论: 本研究发现VEGFR2、血管拟态在胶质母细胞瘤中高表达，且VM形成与VEGFR2表达呈正相关;高表达VEGFR2预示患者预后不良。靶向VEGFR2单克隆抗体(MSB0254)对人源的VEGFR2有很强的亲和力且能与其特异性地结合。MSB0254能够浓度依赖性地阻断VEGFR2与配体VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D的结合。靶向VEGFR2单抗(MSB0254)体外能显著抑制VEGFR2阳性胶质瘤细胞的侵袭、迁移及拟态血管形成;体内能显著抑制裸鼠移植瘤生长、抑制肿瘤增殖、侵袭及血管生成，对移植瘤裸鼠总体生存期有一定程度地改善。 收起