摘要: 骨关节炎(OA)是老龄动物常见的关节疾病，也是引起动物慢性疼痛及运动功能障碍的重要原因之一。OA的发病机制仍未完全阐明，细胞外基质合成与降解失衡引起的不可逆的关节软骨损伤是OA的主要特征。目前针对OA的药物治疗方法非常有限，寻找能缓解疾病症... 展开 骨关节炎(OA)是老龄动物常见的关节疾病，也是引起动物慢性疼痛及运动功能障碍的重要原因之一。OA的发病机制仍未完全阐明，细胞外基质合成与降解失衡引起的不可逆的关节软骨损伤是OA的主要特征。目前针对OA的药物治疗方法非常有限，寻找能缓解疾病症状、延缓疾病进程的药物迫在眉睫。腺苷A3受体(A3AR)在多种疾病中被作为抗炎及镇痛靶点进行研究，激活腺苷A3受体能抑制炎症并缓解慢性神经性疼痛，然而A3AR活化对OA疼痛的作用仍然是未知的。炎症是引起OA细胞外基质降解和疼痛的主要原因，多种促炎细胞因子及炎症信号通路在OA疾病发展过程中发挥重要作用。研究表明，NLRP3炎症小体诱导的细胞焦亡途径是促炎因子的重要来源，抑制NLRP3炎症小体的活化能减轻关节炎症，延缓类风湿性关节炎、痛风及银屑病等疾病的发展;但NLRP3炎症小体介导的焦亡通路在OA软骨退变中的作用仍然是未知的。基于以上问题，论文研究在大鼠OA模型中，NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡通路是否参与OA软骨损伤，阐明A3AR活化是否通过抑制NLRP3/easpase-1/GSDMD通路发挥软骨保护作用。 试验以SD大鼠和大鼠原代软骨细胞为研究对象，分别开展体内和体外研究。 体内试验选取60只SD大鼠，随机分为5组:假手术组(对照组)、ACLT模型组(OA组)、ACLT+CF101治疗组(100μg/kg)、ACLT+MRS1523组(100μg/kg)，以及ACLT+MRS1523+CFl01组(先给予MRSl523，30min后给予CF101)。通过评估软骨病理组织学、检测软骨中细胞外基质合成与降解因子、NLRP3炎症小体通路蛋白及促炎细胞因子的变化，探究A3AR活化对关节软骨损伤是否发挥保护作用以及对NLRP3炎症通路的影响。此外，为了明确NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路在OA软骨破坏中发挥的作用，开展了体外试验，使用H2O2刺激大鼠原代软骨细胞，分为:空白对照组、H2O2组(300μM)、MCC950组(10μM)、MCC950+H2O2组(10μM+300μM)、VX765组(50μM)和VX765+H2O2组(50μM+300μM);检测NLRP3和caspase-1被特异性抑制剂抑制后，关节软骨生物标志物的表达以及NLRP3通路关键蛋白的变化。同时，为进一步阐明腺苷A3受体活化是否通过调控NLRP3炎症小体介导的信号通路发挥作用，体外试验分为6组:空白对照组、H2O2(300μM)组、CF101组、CF101+H2O2(1μM+300μM)组、MRS1523+H2O2(2μM+300μM)组、MRS1523+CF101+H2O2(2μM+1μM+300μM)组;检测NLRP3信号通路、炎症细胞因子以及NLRP3激活的上游信号(细胞内K+、Ca2+以及ROS)的表达情况。 试验结果发现: (1)ACLT术后大鼠的机械痛阈(PWT)持续降低且血清及关节液中疼痛介质COX-2水平明显增加，CF101(腺苷A3受体激动剂)干预后，PWT逐渐提高且COX-2水平降低，表明CF101能减轻大鼠OA疼痛。 (2)通过病理组织学检查，ACLT模型组关节软骨表面出现明显缺损，软骨细胞排列紊乱且基质红染减少，OARSI评分显著增加;CF101治疗组关节软骨损伤轻微，软骨表层出现细胞增殖，OARSI评分显著降低;MRS1523(腺苷A3受体拮抗剂)预处理后再给予CF101，软骨表面损伤明显加重，基质红染大量减少。表明CF101激活A3AR，对软骨发挥保护作用，而MRS1523能抵消CF101对关节软骨的作用。 (3)ACLT组软骨Col-Ⅱ和aggreacan表达下调，软骨基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5表达上调;CF101治疗组Col-Ⅱ和aggreacan增加且MMP-β和ADAMTS-5表达降低;MRS1523+CF101明显逆转CF101对基质降解的缓解作用。 (4)ACLT组软骨NLRP3、ASC、caspase-1及GSDMD蛋白表达显著增加，血清及关节腔灌洗液中IL-1β、IL-18及TNF-α水平显著升高;CF101抑制NLRP3通路蛋白及下游促炎细胞因子的表达;MRS1523+CF101能拮抗CF101的作用;表明A3AR激活能抑制软骨中NLRP3介导的炎症信号通路。 (5)H2O2处理软骨细胞后，LDH释放明显增加，NLRP3、caspase-1p20和GSDMD-N的蛋白表达显著上调，细胞培养上清液中IL-1β和IL-18的水平显著增加;细胞培养上清液中胶原降解生物标志物COMP和CTX-Ⅱ水平增加，蛋白多糖合成生物标志物GAG水平明显降低;使用MCC950(NLRP3特异性抑制剂)和VX765(caspase-1特异性抑制剂)均能明显抑制LDH释放、NLRP3/caspase-1/GSDMD的基因和蛋白表达及IL-1β和IL-18的含量，并降低COMP和CTX-Ⅱ的水平，增加GAG的水平;表明NLRP3/caspase-1通路参与了软骨细胞损伤过程，抑制软骨细胞NLRP3通路能减轻细胞损伤并延缓OA基质降解。 (6)H2O2处理软骨细胞后，NLRP3、caspase-1p20、GSDMD-N的蛋白表达及IL-1β和IL-18的表达水平增加，caspase-1/PI双阳性染色增加，且NLRP3炎症小体上游激活因子K+水平显著降低，Ca2+及ROS水平明显增加，软骨基质降解酶MMP-13和ADAMTS-5蛋白表达明显上调;CF101预处理，软骨细胞中NLRP3通路相关蛋白及促炎细胞因子的表达被抑制，caspase-1/PI双阳性染色显著减少，细胞ROS的水平被明显抑制，K+和Ca2+水平无显著变化，MMP-13和ADAMTS-5蛋白表达明显下调;而MRS1523能拮抗CF101的保护作用。表明CF101通过抑制胞内ROS释放以及NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡通路的活化，抑制软骨细胞炎症反应和细胞外基质降解。 研究结果表明，MCC950和VX765抑制软骨细胞中NLRP3/caspase-1通路并缓解细胞外基质降解;CF101通过激活腺苷A3受体，抑制细胞内ROS的释放，下调NLRP3/caspase-1/GSDMD介导的软骨细胞焦亡和炎症，并减轻软骨基质降解反应，最终减轻OA疼痛及关节软骨损伤，延缓OA进程。 收起