摘要: 背景及目的： 胰腺癌（pancreaticcancer，PC）是一种侵袭性极高的消化系统恶性肿瘤，俗称“癌中之王”，其发病率和死亡率在全球范围内逐年上升，严重危害人类健康。胰腺癌早期诊断困难、恶性程度高，手术切除率低，患者总体5年生存率仅10%。因此，... 展开 背景及目的： 胰腺癌（pancreaticcancer，PC）是一种侵袭性极高的消化系统恶性肿瘤，俗称“癌中之王”，其发病率和死亡率在全球范围内逐年上升，严重危害人类健康。胰腺癌早期诊断困难、恶性程度高，手术切除率低，患者总体5年生存率仅10%。因此，当前胰腺癌的诊治形势依然十分严峻，积极探索胰腺癌发生发展的分子机制以及寻求新的有效治疗靶点具有重要临床意义。TRIM29，作为TRIM蛋白家族中的成员之一，是近年来逐渐受到关注的具有多种生物学功能的蛋白。近年来，已证实TRIM29表达失调与肿瘤的发生发展、增殖、侵袭和转移等密切相关。然而，TRIM29在胰腺癌中的具体生物学功能及机制尚不明确。YAP1蛋白作为细胞内连接蛋白及转录激活因子，是Hippo信号通路中最主要的效应蛋白。大量研究表明YAP1蛋白通过各种方式影响癌症发展，包括促进肿瘤细胞的恶性表型，干性转化和化疗耐药等。然而，YAP1在胰腺癌中的具体调控机制尚未阐明。本研究旨在探讨胰腺癌中TRIM29及YAP1的表达及相关性，进一步深入研究其影响胰腺癌生长及进展的机制。 方法： （1）通过GEPIA数据库在线分析TRIM29在胰腺癌组织中的表达，并采用蛋白质印迹（Westernblotting，WB）、实时荧光定量PCR（QuantitativeRealTimePolymeraseChainReaction，qRT-PCR）及免疫组化（immunohistochemistry，IHC）法检测TRIM29在胰腺癌组织中的表达。统计分析TRIM29表达与胰腺癌患者主要临床特征及预后的关系。 （2）干扰胰腺癌细胞中TRIM29的表达，通过CCK8及EdU实验观察细胞生长能力的变化。构建裸鼠皮下异种移植模型，体内研究TRIM29表达对胰腺癌细胞生长的影响。通过流式细胞术及TUNEL实验检测TRIM29表达改变对细胞周期及细胞凋亡的影响，进一步免疫印迹法检测周期相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达。 （3）改变TRIM29表达后，WB及qRT-PCR法检测胰腺癌细胞中YAP1的表达。WB、qRT-PCR及免疫组化法检测胰腺癌组织及相应非癌组织中YAP1的表达，进一步分析肿瘤组织中TRIM29与YAP1蛋白表达的相关性。设计回复实验，在高表达TRIM29的胰腺癌细胞中敲减TRIM29，同时下调YAP1的表达；在低表达TRIM29的胰腺癌细胞中过表达TRIM29的同时上调YAP1的表达，通过CCK8及EdU实验观察细胞生长能力的变化。 （4）采用蛋白免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）检测胰腺癌细胞中TRIM29与YAP1之间能否直接相互结合。在阻断胰腺癌细胞蛋白降解及合成的基础下，WB法检测过表达或干扰TRIM29后对YAP1蛋白表达的影响。Co-IP实验检测过表达或干扰胰腺癌细胞TRIM29表达后中对YAP1泛素化水平的影响。 结果： （1）GEPIA在线数据库显示TRIM29在胰腺癌组织中的表达显著高于在邻近非肿瘤组织中。WB、qRT-PCR及IHC结果也证实TRIM29在胰腺癌组织中的表达水平显著升高。统计分析提示TRIM29高表达与肿瘤大小（P=0.003）和淋巴结转移（P=0.001）密切相关，但与年龄（P=0.951）、性别（P=0.531）、病理分级（P=0.328）、血管侵袭（P=0.568）及神经浸润（P=0.460）等无显著相关性。且TRIM29表达水平高的患者比TRIM29表达水平低的患者表现出更短的术后总生存期和无瘤生存期。 （2）WB及qRT-PCR结果提示TRIM29在胰腺癌细胞中高表达。CCK8及EdU实验表明，下调胰腺癌细胞中TRIM29的表达后，细胞的生长能力减弱。动物实验也证实干扰TRIM29表达可以显著抑制胰腺癌的生长。流式细胞术检测结果显示，下调胰腺癌细胞TRIM29的表达可以将细胞周期阻滞在G1期，并促进胰腺癌细胞凋亡。免疫印迹结果显示，下调TRIM29的表达可以显著抑制细胞周期相关蛋白cyclinD1和PCNA的表达。同时，敲低TRIM29的表达可以上调BCL-2，并下调Bax和Caspase3的表达。TUNEL分析进一步证实，下调TRIM29的表达增加了异种移植瘤中凋亡细胞的数量。免疫组化分析表明，下调TRIM29可以抑制Ki67的表达。 （3）qRT-PCR及WB结果显示TRIM29可以促进胰腺癌细胞中YAP1的蛋白表达，而对其信使RNA（MessengerRNA，mRNA）表达水平无影响。WB、qRT-PCR及IHC结果证实，YAP1在胰腺癌组织中显著高表达，且与TRIM29的表达水平呈正相关。Kaplan-Meier生存曲线显示，YAP1表达水平高的患者比YAP1表达水平低的患者具有更短的术后总生存时间和无瘤生存时间。回复实验表明，上调YAP1可以促进胰腺癌细胞的增殖能力；且下调TRIM29引起的细胞增殖能力下降可被YAP上调部分逆转；相反，下调YAP1可以抑制胰腺癌细胞的增殖能力；且上调TRIM29引起的细胞增殖能力上升可被YAP下调部分逆转。 （4）Co-IP实验结果显示，胰腺癌细胞中TRIM29蛋白可以和YAP1蛋白直接结合。YAP1蛋白的表达随着蛋白酶抑制剂MG132作用时间的增加而逐渐累积。用阻断蛋白合成的放线菌酮（Cycloheximide，CHX）处理胰腺癌细胞后，过表达TRIM29可以减慢YAP1蛋白的降解速率。进一步研究证实上调TRIM29可以显著抑制YAP1的泛素化水平，而下调TRIM29可以显著增加YAP1的泛素化水平。 结论： TRIM29在胰腺癌组织中高表达，其表达水平与胰腺癌患者恶性进展密切相关。此外，TRIM29可以通过调控YAP1的蛋白表达，进而促进胰腺癌细胞的生长和增殖。机制上，TRIM29直接与YAP1相互结合，通过抑制YAP1的泛素化来稳定其表达，进而发挥促癌功能。我们的结果为研究胰腺癌生长提供了新的理论基础，并将为胰腺癌的靶向治疗提供一个新的理论研究方向。 收起