摘要: 硒(Selenium，Se)是人和动物体成长各个阶段维持正常生理功能不可或缺的微量元素，前期大量研究表明硒在机体抗氧化应激、抗炎、提高机体免疫力、调节生殖系统等方面具有重要作用。在全球范围内，有超过40个国度的人民受到缺硒的困扰，而我国作为世界... 展开 硒(Selenium，Se)是人和动物体成长各个阶段维持正常生理功能不可或缺的微量元素，前期大量研究表明硒在机体抗氧化应激、抗炎、提高机体免疫力、调节生殖系统等方面具有重要作用。在全球范围内，有超过40个国度的人民受到缺硒的困扰，而我国作为世界人口大国，是公认的“缺硒大国”。依照当前中国的领土板块分布情况来看，我国72％的国土面积属于低硒或缺硒地带，土壤中硒含量的严重缺乏，导致缺硒地域上生长的农作物中硒含量也不足，随后通过食物链，导致畜禽肉蛋奶等产品中硒水平的降低，而人长期摄取缺硒的植物和畜禽产物最终导致硒缺乏症的发生。据目前所知，硒蛋白和硒代半胱氨酸是硒参与机体正常生理功能的重要形式，而Txnrd3为硫氧还蛋白还原酶家族的一员，在机体的抗氧化防御及生殖系统中发挥重要作用，但Txnrd3在肝病以及肝纤维化中的功能尚不清楚。 肝纤维化作为一种随着经济发展，发病率逐年升高的肝脏疾病，随着时间的推移可转变为肝硬化甚至是肝癌，与机体抗氧化能力的降低密切相关。是多种因素引起慢性肝损伤的结果，如酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、乙型/丙型肝炎以及胆道疾病诱发的肝病等等。上述的条件均会引起慢性肝炎的发生，长期的炎症刺激和产物会导致肝脏创口和创伤的异常愈合过程。纤维生成是由肌成纤维细胞的激活和增殖引发的，大量研究表明成纤维细胞产生的细胞外基质(ECM)是导致肝脏损伤的主要诱因。 本研究中应用课题组前期构建的Txnrd3-/-小鼠，将野生型和Txnrd3-/-基因型的80只小鼠随机分为两组，分别给予正常水和30％TAA水溶液，自由喂养12周，建立肝纤维化模型，收集肝组织和血清。应用Masson、天狼星红、普鲁士蓝、PAS染色、HE、电镜观察及肝功能生化指标检测肝纤维化模型的成功建立。体外培养AML12和hepal-6，构建Txnrd3/Anxa2过表达和敲低模型，探究其表达改变对AML12和hepal-6细胞及肝纤维化模型中钙稳态基因、细胞焦亡、程序性坏死以及铁死亡相关基因的影响。再应用Co-IP筛选、验证Txnrd3的相互作用蛋白，研究Txnrd3及其相互作用蛋白在肝纤维化中的生物学功能。另外，对肝纤维化机制及研究结果如下: (1)肝脏病理组织学及超微结构观察的结果显示，TAA处理导致野生型小鼠的肝脏组织出现肝细胞肿胀、胞浆空化、个别肝细胞出现坏死和核碎裂;Txnrd3敲除的纯合子小鼠的肝胜损伤更为严重，胶原纤维增多形成假小叶，肝细胞点状坏死，细胞核呈叶状、碎裂甚至溶解，部分细胞破裂，导致细胞内容物的流出。超微结构学观察可见TAA处理组小鼠肝细胞线粒体，粗面内质网肿胀、滑面内质网大量增生，并且纯合子小鼠的细胞器损伤与野生小鼠相比更显著。Masson及天狼星红染色结果显示TAA处理后肝脏组织内胶原纤维含量显著增加，普鲁士蓝染色显示TAA处理后，肝脏组织内铁含量也显著升高;上述结果表明Txnrd3敲除导致肝脏损伤的加剧: (2)抗氧化能力检测结果显示，TAA饮水组野生型小鼠肝脏中的抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)及谷胱甘肽(GSH)活性与对照组相比显著降低，而丙二醛(MDA)含量增加，此外，敲除Txnrd3可以明显降低抗氧化酶的含量和活性，导致肝脏抗氧化能力降低，加剧氧化损伤的发生。结果表明，Txnrd3敲除会加剧TAA诱导的肝脏氧化应激; (3)通过生物信息学分析发现，Txnrd3及其相互作用蛋白主要富集在内质网蛋白进程、钙转运、阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒病、氨基酸的生物合成、碳代谢、糖酵解/糖质新生等细胞信号通路。分子对接结果显示，Txnrd3与Anxa2发生互作所需的能量为.530.89kJ，二者存在极大的互作可能性。免疫共沉淀Co-IP及串联质谱LC-MS的验证结果显示，Txnrd3与Anxa2确实存在相互作用关系。Txnrd3-/-小鼠的肝脏中Anxa2的mRNA和蛋白水平明显低于野生型小鼠。而细胞水平上，Txnrd3过表达或敲低，显著增加或抑制了Hepal-6/AML12细胞中Anxa2的表达。上述结果表明，Txnrd3与Anxa2存在靶向调控关系。 (4)TAA饮水组野生型小鼠肝脏中钙通道相关基因IP3R2、PERK、BIP、RyR与对照组相比mRNA表达水平明显增加，纯合子小鼠与野生型小鼠相比差异更加显著(P＜0.01);IP3R2、RyR及IREI蛋白在TAA处理后与对照组相比表达显著升高，但只有IP3R2在TAA处理后与对照组相比的表达最为显著。hepa1-6细胞中Txnrd3过表达可在mRNA水平上显著上调IP3R2、PERK、XBP1、BIP的表达(P＜0.01);但在AML12细胞中PERK、XBPI、BIP mRNA水平上的表达升高(P＜0.05)，而IP3R2的mRNA表达降低(P＜0.05)。同时，IP3R2在蛋白水平上的表达也呈下降趋势。结果表明Txnrd3敲除能够促进TAA饮水组小鼠肝脏的钙稳态失衡。 (5)TAA饮水组野生型小鼠肝脏中细胞焦亡通道相关基因NLRP3、GSDMD、ASC、Caspasel和IL-1β的表达与对照组相比显著增加，蛋白水平结果显示，与NC纯合组相比，TAA纯合子组中NLRP3、ASC和Caspase1的表达量有所增加。在Txnrd3敲除的hepa1-6细胞模型中发现，Caspase1、NLRP3及GSDMD等细胞焦亡正调控因子的表达丰度显著降低(P＜0.01)，而在AML12细胞中敲除Txnrd3，细胞焦亡基因Caspase1和GSDMD凋亡的表达明显升高(P＜0.01);上述结果表明，Txnrd3敲低通过调节细胞焦亡通道相关基因，加剧小鼠的肝脏损伤和肝脏纤维化。 (6)细胞程序性坏死的正调控基因在TAA诱导的肝纤维化小鼠肝脏中RIPK1、RIPK3及MLKL在mRNA水平上的表达丰度与对照组相比显著增加，在蛋白水平上，纯合子小鼠的RIPK1、RIPK3、MLKL的表达显著高于野生组小鼠;体外培养的hepa1-6细胞的Txnrd3敲低组的呈现相反趋势RIPK1、RIPK3、MLKL、PGAM5表达的减少(P＜0.01)。有趣的是，过表达Txnrd3显著降低了AML12细胞中MLKL、RIPK3和PGAM5在mRNA水平上的表达;上述结果表明，Txnrd3敲低通过上调细胞程序性坏死通道相关基因，进一步加剧小鼠的肝脏损伤和肝脏纤维化。 (7)TAA饮水组野生型小鼠肝脏中铁死亡通路正调控基因TFRC、PTGS2、SLC7A11的mRNA表达丰度显著增加(P＜0.01)，纯合子表达丰度在mRNA水平上与对照组的表达显著增加，在蛋白水平上，纯合子小鼠的FTH1和GPX4的表达均明显降低，而PTGS2的表达显著高于野生组小鼠;在hepa1-6细胞中Txnrd3敲除时铁死亡正调控基因TFRC、PTGS2及SLC7A11的表达水平降低，但其中SLC7A11的下降趋势不显著(P＞0.05)，TFRC及PTGS2呈现极显著的下降;AML12细胞中，Txnrd3过表达时铁死亡相关基因TFRC、PTGS2、SLC7A11、FTH1及FTL在mRNA水平上的表达明显升高(P＜0.01)，但GPX4表达降低。上述结果表明，Txnrd3敲低通过激活铁死亡通路，加剧小鼠的肝脏损伤和肝脏纤维化的发生。 综上所述，试验结果显示，过表达Txnrd3通过IP3R2通道诱导钙稳态失衡，导致内质网应激和氧化应激增加，引起hepal-6细胞焦亡和坏死。免疫荧光检测显示，与肝癌患者相比，肝癌组织中Txnrd3和Anxa2显著降低。相互作用蛋白Txnrd3-Anxa2可导致肝癌组织和hepal-6细胞的焦亡和坏死，这可能是肝癌新的生物标志物和治疗靶点。本研究深入了解了Txnrd3在肝脏疾病中的生物学功能，并为肝纤维化和癌症的早期临床诊断提供了新的靶点和理论基础，为进一步探索Txnrd3的生物学功能提供参考。 收起